Intrazellulärer Transport und Glykosylierung von Hydroxyprolin

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13506 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es hat sich gezeigt, dass die Expression rekombinanter Proteine in Pflanzenzellen mit einem „Designer“-Hydroxyprolin (Hyp)-O-glykosylierten Peptid (HypGP), wie z. B. Tandem-Wiederholungen eines „Ser-Pro“-Motivs, die Ausbeute an sekretierten Proteinen steigert. Eine dramatische Sekretion und Hyp-O-Glykosylierung von HypGP-markierten Proteinen kann jedoch nur erreicht werden, wenn die Pflanzenzellen in stickstoffarmem SH-Medium gezüchtet wurden. Im MS-Medium wurden nur Spuren von sekretiertem Fusionsprotein nachgewiesen. Diese Studie zielt darauf ab, ein tieferes Verständnis des möglichen Mechanismus zu erlangen, der diesen Ergebnissen zugrunde liegt, indem sie den intrazellulären Transport und die Hyp-O-Glykosylierung von verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) untersucht, das mit einem (SP)32-Tag fusioniert ist und aus 32 Wiederholungen eines „ Ser-Pro"-Motiv in Tabak-BY-2-Zellen. Wenn Zellen in MS-Medium gezüchtet wurden, bildete das (SP)32-EGFP ein Proteinkörper-ähnliches Aggregat und blieb im ER zurück, ohne eine Hyp-O-Glykosylierung zu durchlaufen. Im Gegensatz dazu wird das Fusionsprotein vollständig Hyp-O-glykosyliert und dann in SH-Medium sezerniert. Die Transkriptomanalyse der in SH-Medium im Vergleich zu MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen ergab über 16.000 DEGs, wobei viele hochregulierte DEGs mit der Mikrotubuli-basierten Bewegung, der Bewegung subzellulärer Komponenten und der Mikrotubuli-Bindung assoziiert sind. Diese DEGs sind vermutlich für den verstärkten ER-Golgi-Transport von HypGP-markierten Proteinen verantwortlich und ermöglichen deren Glykosylierung und Sekretion im SH-Medium.

Pflanzenzellen haben sich zu einer leistungsstarken Bioproduktionsplattform für rekombinante pharmazeutische Proteine entwickelt, da sie gegenüber anderen eukaryotischen Organismen Vorteile in Bezug auf Sicherheit und Kosteneffizienz bieten1,2,3. Ähnlich wie Säugetierzellen werden Pflanzenzellen in einer sterilen und kontrollierten Umgebung kultiviert und cGMP kann problemlos in der gesamten Produktionspipeline implementiert werden. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte bei der Verbesserung des Pflanzenzellkultursystems erzielt, was zu einigen kommerziellen Erfolgen führte. Insbesondere ist das von der FDA zugelassene Orphan Drug Elelyso® ein aus Pflanzenzellen hergestelltes therapeutisches Enzym (Glukozerebrosidase) zur Behandlung der Gaucher-Krankheit, das zum weltweit ersten aus Pflanzenzellen hergestellten Proteinpharmazeutikum für den Menschen wurde4,5. Trotz dieses Durchbruchs schränken mehrere technische Herausforderungen die weit verbreiteten kommerziellen Anwendungen dieser Plattform ein. Die größte Herausforderung ist die geringe Produktivität mit Proteinausbeuten zwischen 1,0 µg/L und 10 mg/L6,7,8. Darüber hinaus neigt das gewünschte Protein dazu, sich intrazellulär anzusammeln, was zu erhöhten Kosten für die Proteinreinigung führt.

Diese technischen Herausforderungen wurden kürzlich durch eine proprietäre Technologie namens HypGP-Engineering angegangen, bei der ein rekombinantes Protein exprimiert wird, das mit einem Hydroxyprolin (Hyp)-O-glykosylierten Peptid (HypGP)-Tag fusioniert ist, das in Form von Tandemwiederholungen von entweder a vorliegen kann „Ser-Pro“-Motiv oder ein „Ala-Pro“-Motiv, bezeichnet mit (SP)n und (AP)n (n = 5, 10, 20, 32). Der HypGP-Tag könnte als molekularer Träger fungieren und den effizienten Transport verbundener Proteine in Kulturmedien fördern. Infolgedessen hat diese Technologie die Sekretionsausbeute mehrerer rekombinanter Proteine in Pflanzenzellkulturen9,10,11,12,13 und Mikroalgen14 deutlich erhöht. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Sekretion und Hyp-O-Glykosylierung von HypGP-markierten Proteinen in Pflanzenzellen stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums beeinflusst wird15. Bemerkenswerterweise wurden vollständig glykosylierte HypGP-markierte Proteine in großen Mengen sezerniert, wenn BY-2-Zellen in stickstoffarmem Schenk-Hildebrandt-Medium (SH) gezüchtet wurden, was zu einer geringen Akkumulation von Zellbiomasse führte. Im Gegensatz dazu wurde eine geringe Menge an sekretiertem Protein nachgewiesen, wenn BY-2-Zellen in stickstoffreichem Murashige- und Skoog-Medium (MS) gezüchtet wurden16, das ein schnelles Zellwachstum und eine hohe Biomasseakkumulation unterstützte. In beiden Fällen blieben die intrazellulären HypGP-markierten Proteine nicht glykosyliert9,15,17,18. Interessanterweise blieben die meisten synthetisierten Proteine auch nicht glykosyliert, wenn die HypGP-markierten Proteine in ganzen Pflanzen (Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana) exprimiert wurden17,19.

Ziel dieser Studie war es, den möglichen Mechanismus hinter den Unterschieden in der Glykosylierung und Sekretion von HypGP-markierten Proteinen in BY-2-Zellen zu verstehen, die in verschiedenen Medien gezüchtet wurden. BY-2-Zellen, die verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) exprimieren und mit einem (SP)32-Tag (32 Tandemwiederholungen des „Ser-Pro“-Motivs) fusioniert sind,10,15 wurden hauptsächlich als Modellsystem zur Untersuchung des intrazellulären Transports und der Hypnose verwendet. O-Glykosylierung des rekombinanten Proteins. Das Reporter-EGFP-Protein ermöglichte uns eine einfache subzelluläre Lokalisierung der synthetisierten Proteine durch konfokale Mikroskopie. In diese Studie wurden auch BY-2-Zellen einbezogen, die andere Genkonstrukte exprimieren, darunter EGFP-Kontrolle, (AP)20-EGFP (eine andere Art von HypGP-Tag-Design) und (SP)32-SCF (Stammzellfaktor). Anschließend erfolgten Transkriptomanalysen zur Charakterisierung der differentiellen Genexpression der in SH- und MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen.

Die transgenen BY-2-Zellen, die (SP)32-EGFP exprimierten, wurden 12 Tage lang in MS- bzw. SH-Medium gezüchtet. Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden große Unterschiede im Zellwachstum und der Produktion rekombinanter Proteine zwischen den Kulturen in diesen beiden Medientypen beobachtet. Die Zellen wuchsen im MS-Medium viel schneller als im SH-Medium, was zur Ansammlung von 1,8-fach mehr Zellbiomasse im MS-Medium als im SH-Medium führte (Abb. 1A, B). Das SH-Medium förderte jedoch die extrazelluläre Sekretion des Zielproteins, was zu einem 150,2-fachen Anstieg der Menge an sekretiertem Protein führte (Ergänzungstabelle S1). Aufgrund der dramatischen Sekretion des (SP)32-EGFP-Proteins in das SH-Medium färbte sich das Medium hellgrün (Abb. 1A). Im Gegensatz dazu erschien das MS-Medium gelblich. Die grüne Fluoreszenz konnte selbst bei Anregung mit blauem Licht kaum sichtbar gemacht werden. Auch die Morphologie der BY-2-Zellen unterschied sich zwischen der Kultivierung in MS- und SH-Medium. BY-2-Zellen neigten dazu, in SH-Medium Aggregate (1 bis 4 mm) zu bilden, während die Zellen in MS-Medium als feine Suspensionskultur erschienen (Abb. 1A). Der beobachtete Unterschied in der Zellmorphologie ist bei Wildtyp-BY-2-Zellen und anderen transgenen BY-2-Zelllinien (Zellen, die andere heterologe Proteine exprimieren) üblich, die in diesen beiden Medientypen kultiviert werden (ergänzende Abbildung S1).

Zellwachstum und (SP)32-EGFP-Produktion von BY-2-Zellen, kultiviert in MS- und SH-Medium. (A) Bilder der BY-2-Suspensionskultur in zwei verschiedenen Medientypen. Das obere Feld zeigt die BY-2-Zellkultur in Flaschen und das untere Feld zeigt die Pflanzenzellen, betrachtet vom Boden des Kolbens. Das weiße Feld zeigt eine vergrößerte Ansicht der Zellen; (B) Biomasseausbeuten der Zellkultur in MS- und SH-Medium für 12 Tage; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei Replikaten (drei Zellkulturen) dar; (C) Anti-EGFP-Western-Blot-Nachweis des (SP)32-EGFP, das in Medien sezerniert und in Zellen angesammelt wird (Originalbilder siehe ergänzende Abbildung S6A). Die Zellen und Medien wurden nach 3 und 12 Tagen Kultur geerntet. Für die Western-Blot-Analyse wurden Proteine aus der gleichen Menge kultivierter Zellen (1,0 g Frischgewicht) extrahiert. Vollständig glykosyliertes (SP)32-EGFP, nicht-Hyp-O-glykosyliertes (SP)32-EGFP und die von der (SP)32-EGFP-Fusion abgespaltene EGFP-Domäne werden durch den dunklen Pfeil, den grauen Pfeil und den weißen Pfeil angezeigt. jeweils.

Die Sekretion des Fusionsproteins wurde durch die Anti-EGFP-Western-Blot-Analyse weiter bestätigt. Während im SH-Medium eine signifikante Menge an (SP)32-EGFP-Protein nachgewiesen wurde (bis zu 200 mg/l), wurde eine Spurenmenge des Fusionsproteins in das MS-Medium sezerniert (Abb. 1C). Die sekretierte Form des (SP)32-EGFP wanderte bei ~ 115 kDa und wurde früher als vollständig Hyp-O-glykosyliertes Protein identifiziert10,15,20. Interessanterweise waren zusammen mit dem gespaltenen EGFP nur nicht-Hyp-O-glykosylierte Formen von (SP)32-EGFP vorhanden, die mit 40 bis 42 kDa wanderten und vermutlich Monogalactose O-gebunden an den Ser-Rest trugen (42 kDa-Form)17 Domäne (27 kDa) (Abb. 1C).

Ein ähnliches Ergebnis wurde erhalten, als das EGFP in BY-2-Zellen mit einem (AP)20-Tag exprimiert wurde, der aus 20 Wiederholungen eines „Ala-Pro“-Motivs bestand, das eine kürzere HypGP-Kette als der (SP)32-Tag ist (Abb. 2A). Das repetitive „Ala-Pro“-Motiv stellt auch ein typisches Hyp-O-Glykosylierungsmodul in pflanzlichen AGPs21 dar und es wurde zuvor berichtet, dass es die Sekretion fusionierter Proteine in BY-2-Zellkulturen steigert11. Während in dieser Studie vollständig Hyp-O-glykosyliertes (AP)20-EGFP dramatisch in SH-Medium sezerniert wurde, wobei das sezernierte Protein 21,4-fach so hoch war wie das im MS-Medium (Ergänzungstabelle S1), war das nicht-Hyp-O-glykosylierte Form des Proteins, das sich in den Zellen ansammelt. Als Kontrolle wurden auch BY-2-Zellen, die nur EGFP exprimierten (ohne HypGP-Tag), in SH- und MS-Medium gezüchtet. Intrazelluläres und sekretiertes EGFP wurden in zwei Arten von Medien nachgewiesen und beide wanderten in eine einzelne Bande von ~ 27 kDa. Während das intrazelluläre EGFP in SH-Zellen nur 54 % des EGFP in MS-Zellen ausmachte, ist das sekretierte EGFP in SH-Medium 1,8-fach höher als in MS-Medium (Abb. 2B, Ergänzungstabelle S1). Die verstärkte Sekretion von (SP)32- und (AP)20-markiertem EGFP im SH-Medium korrelierte mit dem hohen Glykosylierungsgrad der von BY-2-Zellen synthetisierten rekombinanten Proteine und erreichte 96,2 % bzw. 92,5 % für (SP)32-EGFP bzw. (AP)20-EGFP. Im Gegensatz dazu wurden nur 5,3 % bzw. 31,2 % dieser Proteine im MS-Medium glykosyliert (Ergänzungstabelle S2).

Produktion verschiedener rekombinanter Proteine durch in MS- bzw. SH-Medium gezüchtete BY-2-Zellen. Die Zellen und Medien wurden nach 12 Tagen Kultur geerntet. (A,B) Anti-EGFP-Western-Blot-Nachweis von (AP)20-EGFP und EGFP, das in Medien sezerniert und in Zellen angesammelt wird. (C, D) Anti-SCF-Western-Blot-Nachweis von (SP)32-SCF und SCF, die in Medien sekretiert und in Zellen angesammelt werden (Originalbilder siehe ergänzende Abbildung S6B–E). In (A,B) sind vollständig Hyp-O-glykosyliertes (AP)20-EGFP und (SP)32-SCF durch den dunklen Pfeil gekennzeichnet, nicht-Hyp-O-glykosyliertes (AP)20-EGFP und (SP). )32-SCF bzw. grauer Pfeil. In Panel (C,D) stellen die obere und untere Bande die N-glykosylierte bzw. die nicht-N-glykosylierte Form von SCF dar.

Um zu untersuchen, ob die Auswirkungen des Mediums auf die Proteinexpression und -sekretion proteinspezifisch sind, wurde ein therapeutisches Protein, der menschliche Stammzellfaktor (SCF), auch in BY-2-Zellen mit und ohne N-terminalen (SP)32-Tag exprimiert. Ähnlich wie bei der Expression von (SP)32-EGFP oder (AP)20-EGFP wurde im SH-Medium 12,1-mal mehr sekretiertes (SP)32-SCF nachgewiesen als im MS-Medium, obwohl intrazelluläres (SP)32-SCF scheinbar nicht vorhanden war -Hyp-O-glykosyliert (MG 34 bis 36 kDa), akkumuliert etwas stärker in MS-Zellen als in SH-Zellen (Abb. 2C, Ergänzungstabelle S1). Auch hier wurde im SH-Medium ein viel höherer Hyp-O-Glykosylierungsgrad des synthetisierten Proteins festgestellt als im MS-Medium (Ergänzungstabelle S2). Was die Expression der SCF-Kontrolle betrifft, so waren die im SH-Medium nachgewiesenen sekretierten Proteine 2,2-mal höher als die im MS-Medium, obwohl ihr intrazellulärer Gehalt ähnlich war (Abb. 2D, Ergänzungstabelle S1), was der Expression der EGFP-Kontrolle ähnelte . In allen oben genannten Fällen akkumulierten transgene BY-2-Zellen im SH-Medium weniger Zellbiomasse als im MS-Medium (ergänzende Abbildung S1).

Das Expressionsniveau des (SP)32-EGFP- und (SP)32-SCF-Transgens in den in SH- und MS-Medium kultivierten BY-2-Zellen wurde dann durch RT-qPCR bestimmt. Interessanterweise gab es keinen signifikanten Unterschied in den Expressionsniveaus der beiden Zieltransgene in BY-2-Zellen, die in der exponentiellen Wachstumsphase (~ 8 Tage) gezüchtet wurden (Abb. 3). Offensichtlich gibt es andere Faktoren, die für den beobachteten Unterschied in der Hyp-O-Glykosylierung und Sekretion der manipulierten Fusionsproteine zwischen den in SH- und MS-Medium kultivierten BY-2-Zellen verantwortlich sind.

RT-qPCR-Nachweis der Expression des (SP)32-EGFP-Transgens in BY-2-Zellen, die in MS- bzw. SH-Medium gezüchtet wurden. Nach 8 Tagen Subkultur wurden drei biologische Replikate von (SP)32-EGFP oder (SP)32-SCF exprimierenden BY-2-Zellen gesammelt, die in SH- und MS-Medium gewachsen waren. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den mRNA-Spiegeln zwischen den in SH- und MS-Medium kultivierten BY-2-Zellen.

Wir untersuchten weiterhin die subzelluläre Lokalisierung des synthetisierten (SP)32-EGFP unter einem konfokalen Mikroskop. Wie in Abb. 4 gezeigt, konnte beim Wachstum der BY-2-Zellen in SH-Medium ein erhebliches Fluoreszenzsignal in verschiedenen Zellorganellen beobachtet werden, insbesondere um den Zellkern und an der Zellmembran, wie bereits berichtet10. Darüber hinaus wurde bei der Untersuchung der kortikalen Schicht ein Netznetzwerk beobachtet, was darauf hinweist, dass (SP)32-EGFP im endoplasmatischen Retikulum (ER-Netzwerke) vorhanden war. Bemerkenswerterweise wurden bei der Untersuchung der in MS-Medium gewachsenen Zellen viele grüne Aggregate mit einer Größe von 1 bis 10 μm entdeckt. Diese Aggregate sind relativ größer als die Golgi-Körper, die bei Betrachtung unter einem konfokalen Mikroskop normalerweise als punktförmige Strukturen mit einem Durchmesser von 1 bis 2 μm beobachtet werden22. Ähnliche Ergebnisse wurden in BY-2-Zellen beobachtet, die (AP)20-EGFP exprimieren. Im Gegensatz dazu wurden in Zellen, die die EGFP-Kontrolle ohne HypGP-Tag exprimierten, keine grünen Aggregate beobachtet. Dieser Befund legt nahe, dass das (SP)32- oder (AP)20-Modul möglicherweise für die Bildung dieser grünen Aggregate verantwortlich war.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von transgenen BY-2-Zellen, die in MS- und SH-Medium gezüchtet wurden. BY-2, das (SP)32-EGFP oder EGFP-Kontrolle exprimiert, wurde 6 Tage lang sowohl in SH- als auch in MS-Medium gezüchtet, bevor es mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop untersucht wurde. BY-2-Zellen wurden sowohl im Querschnitt (obere Felder) als auch im kortikalen Zytoplasma (untere Felder) unter dem grünen Fluoreszenzkanal eingefangen. Maßstabsbalken = 25 µm. Fluoreszierende retikulierte ER-Netzwerke waren im gesamten kortikalen Zytoplasma der BY-2-Zellen zu sehen, mit Ausnahme der (SP)32-EGFP- und (AP)20-EGFP-Zellen, die in MS-Medium gezüchtet wurden.

Die Bildung der grünen Aggregate war auch von der Kulturzeit abhängig (Abb. 5). In der Verzögerungswachstumsphase (Tag 3), als die Synthese des rekombinanten Proteins gerade begann, war die intrazelluläre Verteilung der grünen Fluoreszenz ähnlich der der EGFP-Kontrollzellen, obwohl einige kleine Aggregate (~ 1 μm im Durchmesser) beobachtet werden konnten einige Zellen. Während die Zellen vom 6. bis zum 12. Tag schnell wuchsen, bildeten sich viel mehr grün fluoreszierende Aggregate, und die Größe der Aggregate nahm auf bis zu 10 μm zu. Am Ende der Kultur konnten Aggregate mit einem Durchmesser von 13 μm gefunden werden. Dies deutete darauf hin, dass die Akkumulation der grün fluoreszierenden Aggregate ein dynamischer Prozess war und mit dem Zellwachstumsstadium (Proteinsyntheserate) zusammenhängt.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von BY-2-Zellen, die (SP)32-EGFP exprimieren, nachdem sie für unterschiedliche Zeiträume in MS-Medium gewachsen sind. BY-2-Zellbilder wurden im Querschnitt unter einem grünen Fluoreszenzkanal mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 25 µm.

Um die subzelluläre Lokalisierung der (SP)32-EGFP-Aggregate in Pflanzenzellen zu untersuchen, wurden BY-2-Zellen, die (SP)32-EGFP exprimieren, weiter mit einem Gen übertragen, das für einen ER-Marker (mCherry-HDEL) und einen Golgi-Marker (Man49-HDEL) kodiert. mCherry). Die in Abb. 6A gezeigten Ergebnisse zeigten, dass sich fast alle grün fluoreszierenden Aggregate im ER-Netzwerkbereich befanden; mit anderen Worten, sie überlappten mit dem rot fluoreszierenden ER-Marker. Dies war dasselbe wie die exprimierte EGFP-Kontrolle, bei der immer festgestellt wird, dass sie mit dem ER-Netzwerk kolokalisiert, während sie zur Sekretion über den Standard-ER-Golgi-Weg transportiert wird. Bei der Cotransformation von (SP)32-EGFP-Zellen mit dem Golgi-Marker wurden die grün fluoreszierenden Aggregate mit den roten diskreten Golgi-Körpern getrennt, während der Großteil der exprimierten EGFP-Kontrolle während des Transports durch den ER-Golgi-Weg mit dieser Organelle überlappte ( Abb. 6B). Dies deutete darauf hin, dass das synthetisierte (SP)32-EGFP-Fusionsprotein im ER zurückgehalten werden konnte, ohne es zu verlassen, und anschließend zum Golgi-Apparat transportiert werden konnte. Dies stimmte mit der Beobachtung überein, dass praktisch alle intrazellulären Fusionsproteine nicht Hyp-O-glykosyliert waren (Abb. 1C), da die Hyp-O-Glykosylierung im Golgi-Apparat stattfand23.

Subzelluläre Lokalisierung von (SP)32-EGFP und EGFP, exprimiert in BY-2-Zellen. (A) Kolokalisierung von (SP)32-EGFP oder EGFP-Kontrolle mit ER-Marker (mCherry-HDEL); (B) Kolokalisierung von (SP)32-EGFP oder EGFP-Kontrolle mit Golgi-Marker (Man49-mCherry). Transgene BY-2-Zellen wurden 6 Tage lang in MS-Medium gezüchtet, bevor sie mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop untersucht wurden. Zellbilder wurden sowohl im grünen Fluoreszenzkanal als auch im roten Fluoreszenzkanal mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen. Das weiße Feld zeigt eine vergrößerte Ansicht des Bildes; Maßstabsbalken = 25 µm.

Um den Mechanismus, der für die Bildung grün fluoreszierender Aggregate in (SP)32- oder (AP)20-markierten EGFP-Zellen verantwortlich ist, und die subzelluläre Lokalisierung der Aggregate besser zu verstehen, wurden BY-2-Zellen, die (SP)32-EGFP exprimieren, untersucht mit BFA behandelt, einem Pilztoxin, das den Proteintransport zwischen dem ER und dem Golgi-Apparat blockiert, indem es die Golgi-Stapel schnell zerstört24. Als Kontrolle wurden auch BY-2-Zellen, die die EGFP-Kontrolle exprimierten, auf die gleiche Weise behandelt. Wie in Abb. 7 gezeigt, veränderte die BFA-Behandlung die subzelluläre Lokalisierung des (SP)32-EGFP erheblich. Eine Stunde nach der Inkubation mit BFA konnten in den Zellen kleine grün fluoreszierende Aggregate von 1–2 μm beobachtet werden. Bei längerer Inkubation mit BFA über 2 und 4 Stunden bildete sich eine viel größere Anzahl grün fluoreszierender Aggregate und der Durchmesser der Aggregate erhöhte sich ebenfalls auf bis zu 8 μm. Dies entsprach dem frühen Bericht, in dem sich nach der BFA-Behandlung in Haarwurzeln, die (SP)32-EGFP17 exprimierten, Proteinaggregate bildeten. Interessanterweise induzierte die BFA-Behandlung auch die Bildung grün fluoreszierender Aggregate in EGFP-exprimierenden Zellen, und der Prozess war der gleiche wie in den (SP)32-EGFP-Zellen. Diese Veränderungen deuteten darauf hin, dass die BFA-Behandlung den Transport von synthetisiertem (SP)32-EGFP und EGFP vom ER zum Golgi-Apparat erfolgreich blockierte, was zur Akkumulation von (SP)32-EGFP oder EGFP im ER und zur Bildung grüner fluoreszierender Aggregate führte.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von transgenen BY-2-Zellen, die mit BFA behandelt wurden. Die (SP)32-EGFP oder EGFP exprimierenden BY-2-Zellen wurden 6 Tage lang in SH-Medium gezüchtet und dann 1, 2 und 4 Stunden lang mit BFA behandelt. Die Zellen wurden unter einem grünen Fluoreszenzkanal mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv eingefangen. Maßstabsbalken = 25 µm. Bei beiden Zelltypen konnten nach einstündiger Behandlung grün fluoreszierende Aggregate beobachtet werden. Bei längerer BFA-Behandlung von bis zu 4 Stunden bildeten sich mehr und größere Aggregate.

Um einen umfassenden molekularen Mechanismus aufzudecken, der einer höheren Sekretion von HypGP-markiertem Protein in in SH-Medien kultivierten BY-2-Zellen, aber der Bildung von Proteinaggregaten/Proteinkörpern in MS-Medium zugrunde liegt, wurde die Gesamt-mRNA sequenziert, um die unterschiedliche Genexpression in BY-2 zu identifizieren Zellen kultiviert in SH-Medium mit MS-Medium (als Kontrolle). Hier wurde die Wildtyp-BY-2-Zelle anstelle der transgenen BY-2-Zelle für die Transkriptomanalyse verwendet, um den Einfluss der genetischen Transformation und der kontinuierlichen Selektion von Elite-Zelllinien auf die Eigenschaften der Zelllinie zu vermeiden, da diese Prozesse möglicherweise dazu führten zu einigen zusätzlichen Mutationen der Zelllinie25. Darüber hinaus waren die beobachteten Ergebnisse, einschließlich einer verbesserten Hyp-O-Glykosylierung und Proteinsekretion, bei der Expression verschiedener HypGP-markierter Proteine in BY-2-Zellen gleich, was darauf hindeutet, dass die Mediumeffekte unabhängig von den in das Genom integrierten heterologen Genen waren der Zellen.

Drei RNA-seq-Bibliotheken wurden für in MS- bzw. SH-Medium kultivierte BY-2-Zellen erstellt (drei biologische Replikate für jedes Kulturmedium). Die von jeder Bibliothek generierten Rohlesevorgänge lagen zwischen 20.250.845 und 22.832.945. Nach dem Entfernen der Lesevorgänge mit geringer Qualität und der Adaptersequenzen wurden die gesamten sauberen Lesevorgänge mit dem Genom von N. tabacum kartiert. Die Ergebnisse zeigten, dass 95,81–96,76 % aller Lesevorgänge der sechs Bibliotheken eindeutig dem Genom von N. tabacum zugeordnet waren, wovon mehr als 93 % eindeutigen Orten zugeordnet waren. Die Sequenzierungsdaten und die Kartierung der RNA-seq-Daten wurden in der Ergänzungstabelle S4 zusammengefasst. Das Ausmaß der Genexpression wurde anhand der Häufigkeit der Transkripte quantifiziert, die Exons zugeordnet waren. Der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen den Proben und die Verteilung der Genexpression unter den beiden Kulturbedingungen ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt.

DEGs wurden durch Vergleich der Genexpression von in SH kultivierten BY-2-Zellen mit der in MS-Medium unter Verwendung von DESeq2 mit einem p-Wert < 0,0526 identifiziert. Es wurde festgestellt, dass 16.373 Gene unterschiedlich exprimiert wurden, darunter 8183 hochregulierte und 8190 herunterregulierte Gene (Abb. 8). Die Liste der stark herunterregulierten Gene wurde von Genen dominiert, die Zellwandstrukturproteine codieren, wie z. B. gp1-ähnliche, prolinreiche und glycinreiche Zellwandstrukturproteine des vegetativen Zellwandproteins, sowie zellwandmodifizierende Enzyme und Proteasen, wie wahrscheinlich Polygalacturonase und Aspartylprotease AED3-like, obwohl Gene, die für Osmotin-like-Protein, Zinktransporter 11-like und Purple Acid Phosphatase kodieren, sowie viele nicht charakterisierte Gene bemerkenswert waren (Ergänzungstabelle S5). Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Gene, die für Alkanhydroxylase MAH1-like, Auxin-responsives Protein IAA9-like, Phospholipase A1, seneszenzspezifisches Cysteinprotease-like, Tubulin Beta-1-Kette und viele nicht charakterisierte Gene kodieren, hochreguliert sind (Ergänzungstabelle S6). .

Expressionsgene in BY-2-Zellen, die in SH-Medium gezüchtet wurden, im Vergleich zu denen in MS-Medium. (A) Venn-Diagramm der Expressionsgene; (B) Vulkandiagramm der DEGs. Die Abszisse zeigt den Fold-Change-Unterschied in der Expression von Genen in verschiedenen Gruppen und die vertikalen Koordinaten geben die p-Werte für die Unterschiede in der Expression an. Die hochregulierten Gene werden durch rote Punkte dargestellt, die herunterregulierten Gene durch grüne Punkte. Gene ohne signifikante Unterschiede werden durch blaue Punkte gekennzeichnet.

Obwohl nicht stark hoch- oder herunterreguliert, kodieren Gene für Prolyl-4-hydroxylase (P4H), die die Hydroxylierung von Prolinresten katalysieren, und zwei Schlüsselgruppen von Glykosyltransferasen, die für den Aufbau der Hyp-O-Glykane, Hyp-O-Galactosyltransferase (Hyp:GlaT), verantwortlich sind ) und β-1,3-Galactosyltransferase (Gal:GalT) wurden ebenfalls auf ihre Expressionsmuster analysiert. Es wurden fünf DEGs für P4H, 3 DEGs für Hyp:Gla und 5 DEGs für Gal:GalT identifiziert. Während die meisten Gene, die für P4H- und Hyp:GlaT-Isoformen kodieren, herunterreguliert wurden, als die BY-2-Zellen in SH-Medium gezüchtet wurden, wurden Gene, die für alle vier Gal:GalT-Isoform-Gene kodierten, in SH-Medium hochreguliert (ergänzende Abbildung S3).

Um eine funktionale Annotation der DEG-Datensätze zu erhalten, haben wir alle DEGs mit den GO- und KEGG-Datenbanken abgeglichen. Basierend auf unseren Ergebnissen wurden 68 GO-Begriffe durch hochregulierte Gene und 23 GO-Begriffe durch herunterregulierte Gene signifikant angereichert. Einige bemerkenswerte biologische Prozesse, einschließlich der Bewegung von Zellen oder subzellulären Komponenten, mikrotubulibasierter Bewegung, negativer Regulierung zellulärer Prozesse, Regulierung der Organisation zellulärer Komponenten, proteinkatabolischer Prozesse und Zellzyklus, wurden mit überexprimierten Genen in kultivierten BY-2-Zellen in Verbindung gebracht SH mittel. Darüber hinaus reichern hochregulierte Gene vier zelluläre Komponenten an, darunter den Proteasom-Komplex, den Endopeptidase-Komplex, den Proteasom-Kernkomplex und den Peptidase-Komplex, sowie über zehn molekulare Funktionen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mikrotubuli-Bindung, Tubulin-Bindung, Protein-Heterodimerisierungsaktivität und Proteinkinase-Inhibitor-Aktivität usw . (Abb. 9A). Andererseits waren RNA-Spleißen, Zellwandmodifikation, Zellwandorganisation/-biogenese und Proteinimport einige der bemerkenswerten biologischen Prozesse, die durch herunterregulierte Gene bereichert wurden. Insbesondere fanden wir heraus, dass Zellwand, Ribosome und Zellperipherie einige der bemerkenswerten Zellbestandteile waren, die durch herunterregulierte Gene angereichert wurden. Außerdem wurden vier molekulare Funktionen, einschließlich saurer Phosphataseaktivität, Carbonsäureesterhydrolaseaktivität, Pektinesteraseaktivität und struktureller Bestandteil des Ribosoms, durch herunterregulierte Gene überrepräsentiert (Abb. 9B). Aus der Analyse des KEGG-Signalwegs haben wir herausgefunden, dass die DNA-Replikation und der Phagosomen-Signalweg durch hochregulierte Gene und der Spleißosomen-Signalweg durch herunterregulierte Gene signifikant angereichert waren (ergänzende Abbildung S4).

GO-Anreicherungsanalyse von in SH-Medium kultivierten BY-2-Zellen im Vergleich zu MS-Medium. Es werden hochregulierte GO-Terme (A) und herunterregulierte GO-Terme (B) vorgestellt, die spezifisch für den biologischen Prozess (BP), zelluläre Komponenten (CC) und molekulare Funktion (MF) sind. Die zehn häufigsten GO-Begriffe in jeder Kategorie werden in absteigender Reihenfolge nach dem angepassten p-Wert [− log10(padj)] geordnet. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied bei p < 0,05 an.

Um die unterschiedliche Regulation der in der RNA-Seq-Analyse identifizierten Gene weiter zu bestätigen, haben wir zwei hochregulierte Gene, das Alkanhydroxylase-MAH1-ähnliche Gen (LOC107798865) und das Laccase-15-ähnliche Gen (LOC107829253), sowie zwei herunterregulierte Gene, das Polygalacturonase-Gen, kreuzvalidiert (LOC107824442) und das gp1-ähnliche Gen des vegetativen Zellwandproteins (LOC107802007) durch RT-qPCR. Unsere Daten bestätigten, dass das Alkanhydroxylase-MAH1-ähnliche Gen und das Laccase-15-ähnliche Gen in den in SH-Medium kultivierten BY-2-Zellen signifikant um das 6,0-fache bzw. 3,2-fache hochreguliert waren (ergänzende Abbildung S5). Ersteres ist ein integraler Bestandteil der Membran und hat die molekulare Funktion der Oxidoreduktase-Aktivität und der Eisenionenbindung27, und letzteres ist an der Ligninsynthese in Pflanzen beteiligt28. In ähnlicher Weise zeigten die beiden stark herunterregulierten Gene, darunter das für Polygalacturonase und das für das vegetative Zellwandprotein gp1-like kodierende Gen, konsistente Ergebnisse in der RT-qPCR-Analyse (ergänzende Abbildung S5). Polygalacturonase ist ein sekretorisches Enzym, das in der Zellwand von Pflanzenzellen lokalisiert ist und dessen Funktion darin besteht, (1–4)-α-d-Galactosiduronbindungen in Pektat und anderen Galacturonanen zufällig zu hydrolysieren29. Das vegetative Zellwandprotein gp1 ist ein hydroxyprolinreiches Glykoprotein (HRGP)-1, das als Hauptbestandteil der äußeren (kristallinen) Zellwandschicht fungiert30.

Die Expression heterologer Proteine mit einem HypGP-Tag, wie (SP)n und (AP)n, in Pflanzenzellen erhöhte die sezernierten Ausbeuten der Proteine dramatisch. Dies wurde bei der Expression vieler Proteine in Pflanzenzellen (Tabak und Arabidopsis)9,10,11,12,13,18 sowie in Mikroalgen14 gezeigt. Hinsichtlich der Funktionalität wurde festgestellt, dass der weitgehend Hyp-O-glykosylierte HypGP-Tag die Serumhalbwertszeit kleiner therapeutischer Proteine wie menschliches Wachstumshormon und Interferon α2 erheblich verlängert, ohne deren Bioaktivität wesentlich zu beeinträchtigen12,13. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der mit Hyp-Glykanen dekorierte HypGP-Tag bei Injektion in Mäuse nicht immunogen ist und bei Injektion als Fusionsprotein nur geringfügig immunogen ist12. Für therapeutische Proteine, deren klinische Anwendung es jedoch erfordert, dass sie in nativer Form vorliegen, könnte zwischen dem HypGP-Tag und den Zielproteinen eine spezifische proteolytische Spaltstelle, die beispielsweise von Enterokinase erkannt wird, entworfen werden.

Interessanterweise hängen die Sekretion und Hyp-O-Glykosylierung von HypGP-markierten Proteinen in BY-2-Zellen stark vom Kulturmedium ab. Während im SH-Medium eine hohe Ausbeute an sekretiertem Protein erzielt wurde, wurden im MS-Medium Spuren von sekretiertem Protein nachgewiesen15,17. Darüber hinaus traten die exprimierten Proteine in beiden Medientypen als unterschiedliche Glykoformen auf und waren vollständig zwischen den Mediumfraktionen (vollständig glykosylierte Form) und den Zellen (nicht-Hyp-O-glykosylierte Form) getrennt10,17. Ziel dieser Studie war es, den möglichen molekularen Mechanismus hinter dem beobachteten Unterschied in der Glykosylierung und Sekretion von HypGP-markierten Proteinen zu verstehen, indem der intrazelluläre Transport der synthetisierten Proteine untersucht und das Transkriptom der in SH- und MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen analysiert wurde. Wenn man bedenkt, dass die Designer-Tags (SP)n und (AP)n die charakteristischen Glykosylierungsmodule von AGPs sind, einem der wichtigsten Glykoproteine der pflanzlichen Zellwand31,32, wird die Analyse des intrazellulären Transports und der Hyp-O-Glykosylierung dieser Module ebenfalls voranschreiten unser Verständnis der Biosynthese und Funktionen von strukturellen Glykoproteinen pflanzlicher Zellwände.

Es wurde festgestellt, dass die mittleren Auswirkungen auf die Glykosylierung und Sekretion von synthetisiertem Protein bei der Expression verschiedener HypGP-markierter Proteine, einschließlich verschiedener Designs von HypGP-Tags [(SP)32 und (AP)20] und verschiedener Arten von Proteinen, gemeinsam sind ( EGFP und SCF) (Abb. 1, 2). Der Effekt war jedoch nicht so offensichtlich, wenn das nicht-HypGP-markierte Protein (EGFP und SCF) in BY-2-Zellen exprimiert wurde (Abb. 2B, D), obwohl die Pflanzenzellen in SH-Medium immer langsamer wuchsen als in MS-Medium (Ergänzende Abbildung S1). RT-qPCR ergab, dass es keinen signifikanten Unterschied in den Transkriptionsniveaus der Transgene (SP)32-EGFP und (SP)32-SCF in BY-2-Zellen gab, die in diesen beiden Medientypen kultiviert wurden (Abb. 3). Dies zeigte auch, dass der konstitutive 35SCaMV-Promotor, der die Expression der Transgene in BY-2-Zellen steuert, unabhängig vom Kulturmedium war. Angesichts der Tatsache, dass eine identische mRNA-Sequenz in vergleichbaren Mengen in BY-2-Zellen produziert wurde, die in zwei verschiedenen Medien kultiviert wurden, kann gefolgert werden, dass die resultierende Proteinsynthese durch Translation ebenfalls vergleichbar ist. Daher wären andere posttranslationale Faktoren für den beobachteten Unterschied in der Hyp-O-Glykosylierung und Sekretion des manipulierten HypGP-Moduls verantwortlich.

Eine weitere Untersuchung der subzellulären Lokalisierung synthetisierter (SP)32- und (AP)20-markierter EGFP-Zellen ergab, dass sich im ER von in MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen viele grün fluoreszierende Aggregate bildeten (Abb. 4) und deren Größe zunahm mit der Zeit (Abb. 5). Dies bestätigte die Beobachtungen, dass HypGP-markierte Proteine kaum in das MS-Medium sezerniert wurden und die intrazellulären Fusionsproteine nicht Hyp-O-glykosyliert waren, da Hyp-O-Glykosylierung in Golgi auftritt. Im Gegensatz dazu fehlten solche Aggregate in den in SH-Medium gezüchteten BY-2-Zellen, was zu einer dramatischen Sekretion der vollständig Hyp-O-glykosylierten Proteine führte. Interessanterweise wurden in den BY-2-Zellen, die die EGFP-Kontrolle exprimierten, weder in MS- noch in SH-Medium kultivierte grün fluoreszierende Aggregate beobachtet (Abb. 4). Offensichtlich war der HypGP-Tag für die Bildung der grün fluoreszierenden Aggregate in den in MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen verantwortlich, sodass das synthetisierte Protein in den Pflanzenzellen verblieb.

Die beobachteten EGFP-Aggregate ähnelten den Proteinkörpern (PBs), die natürlicherweise als Speicherorganellen in Samen vorkommen33. Es wurde zuvor berichtet, dass sich PBs im ER von Pflanzenblättern bilden, beispielsweise in N. benthamiana und N. tabacum, wenn Fremdproteine in hohen Mengen im ER synthetisiert wurden und wenn sie mit einem von drei speziellen Tags fusioniert wurden: Zera (eine Domäne von das Maissamen-Speicherprotein Gamma-Zein), Elastin-ähnliche Polypeptide (ELP) oder Hydrophobin-I (HFBI)34,35,36,37,38. Die Bildung von PBs in Pflanzenzellen, wie z. B. BY-2-Zellen, könnte auch durch Fusion mit HFBI25,39 induziert werden. Im Fall der Expression von HypGP-markierten Proteinen in BY-2-Zellen schien das synthetische HypGP-Modul wie (SP)32 oder (AP)20 wie der ELP- oder HFBI-Tag zu wirken und die Bildung der Proteinaggregate zu induzieren ER. Dies geschah jedoch nur, wenn die BY-2-Zellen in MS-Medium und nicht in SH-Medium gezüchtet wurden, was sich von der Funktion der ELP- und HFBI-Tags unterschied, die immer die Bildung von PBs in ER beinhalteten. Unsere Studie hat auch gezeigt, dass die BFA-Behandlung der BY-2-Zellen, die die sekretorischen Proteine im ER behielten, die Bildung grün fluoreszierender Aggregate von (SP)32-EGFP im SH-Medium oder sogar in der EGFP-Kontrolle induzierte (Abb. 7). . Über die Bildung von PBs in Pflanzenzellen allein aufgrund einer hohen Anreicherung rekombinanter Proteine im ER (> 0,2 % des gesamten löslichen Proteins) ohne die Notwendigkeit eines Fusions-Tags wurde bereits berichtet34. In unserem Fall könnte das Vorhandensein des synthetischen HypGP-Tags einfach den ER-Austritt des Fusionsproteins verhindern, wenn die BY-2-Zellen in MS-Medium wachsen, und so die Bildung von PBs-ähnlichen Aggregaten induzieren. Zu diesem Zweck müssen erhebliche Unterschiede in den biologischen und zellulären Prozessen zwischen den in diesen beiden Medienarten gezüchteten Pflanzenzellen auftreten.

Wie bereits berichtet, besteht der Hauptunterschied zwischen SH- und MS-Medium in den Makronährstoffen, insbesondere im Stickstoffgehalt15. Das MS-Medium enthält nicht nur einen deutlich höheren Gesamtstickstoffgehalt im Vergleich zum SH-Medium (60,1 mM in MS vs. 27,3 mM in SH), sondern auch eine erhebliche Konzentration an NH4+ (Ergänzungstabelle S3). Infolgedessen ist das NO3−/NH4+-Verhältnis im MS-Medium viel niedriger als das im SH-Medium, mit einem Verhältnis von 1,9 in MS und 9,5 in SH. Die beobachtete geringe Akkumulation von Zellbiomasse im SH-Medium wurde wahrscheinlich durch eine unzureichende Stickstoffversorgung im „Stickstoffmangel“-SH-Medium und/oder ein unausgeglichenes NO3-/NH4+-Verhältnis verursacht. Interessanterweise könnte die Modifizierung der Makronährstoffe des MS-Mediums mit reduziertem NH4NO3-Gehalt (von der Hälfte des ursprünglichen Gehalts auf NH4NO3-frei) eine hochwirksame Sekretion des vollständig glykosylierten (SP)32-EGFP auslösen, obwohl die Zellbiomasse stark reduziert wurde15. Die Stickstoffquelle und -verfügbarkeit gelten als entscheidende Faktoren für die Produktivität pflanzlicher Zellkulturen, da sie eine zentrale Rolle im Pflanzenzellstoffwechsel spielen und in direktem Zusammenhang mit der Aminosäure- und Proteinbiosynthese stehen40. Es wurde bereits berichtet, dass die Ergänzung pflanzlicher Zellkulturen mit zusätzlichem Stickstoff die Akkumulation rekombinanter Proteine steigert41,42. Wenn jedoch HypGP-markierte Proteine in Pflanzenzellen exprimiert wurden, führte die Verwendung von Medium mit hohem Stickstoffgehalt, wie z. B. MS-Medium, dazu, dass das Fusionsprotein im ER zurückgehalten wurde und PBs-ähnliche Aggregate bildete, obwohl es das Zellwachstum förderte. Es wurde festgestellt, dass nur ein Medium mit niedrigeren Stickstoffgehalten, wie beispielsweise SH-Medium, besser geeignet ist, den ER-Austritt von Fusionsproteinen zu fördern und eine anschließende Hyp-O-Glykosylierung und Sekretion zu ermöglichen.

Neben Stickstoff, einem der wichtigsten Mikronährstoffe, ist auch die Konzentration von Zn2+ (ZnSO4) im SH-Medium wesentlich geringer als im MS-Medium (8,6-fach geringer). Die Konzentration dieses Ions zeigte jedoch keinen Einfluss auf die Hyp-O-Glykosylierung und Sekretion der HypGP-markierten Proteine in BY-2-Zellen15, obwohl festgestellt wurde, dass das Gen, das für das Zinktransporter-11-ähnliche Protein kodiert, deutlich herunterreguliert war das SH-Medium (Ergänzungstabelle S5). Dasselbe gilt für Mn2+- und Fe2+-Ionen; Ihre Konzentrationen im SH-Medium betragen etwa die Hälfte derjenigen im MS-Medium (Ergänzungstabelle S3), sie hatten jedoch keinen Einfluss auf die Sekretion von HypGP-markierten Proteinen .

Der auffällige Unterschied im Zellwachstum, der Zellmorphologie und der Sekretion rekombinanter Proteine, der zwischen in MS- und SH-Medium gezüchteten BY-2-Zellen beobachtet wurde, insbesondere im Hinblick auf den intrazellulären Transport und die Hyp-O-Glykosylierung der HypGP-markierten Proteine, lässt auf signifikante Veränderungen schließen Innerhalb der Zellen fanden biologische Prozesse statt. Dies veranlasste uns, eine RNAseq-Analyse durchzuführen, um die transkriptomische Reaktion von BY-2-Zellen auf stickstoffarme SH-Medien zu verstehen. Die Zuordnung der Lesevorgänge mit dem Genom von N. tabacum betrug 95–96 % (Ergänzungstabelle S4), was auf eine leichte Mutation der BY-2-Zelllinie zurückzuführen ist, die seit 1981 kontinuierlich in vitro kultiviert wird. Dies ist erwähnenswert Es wurde festgestellt, dass über 16.000 Gene unterschiedlich exprimiert werden, obwohl sowohl SH- als auch MS-Medium die Vermehrung von BY-2-Zellen in vitro ordnungsgemäß unterstützen konnten. Über eine transkriptomweite Analyse von BY-2-Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Methyljasmonat wurde bereits früher berichtet. Die Ergebnisse zeigten auch eine große Anzahl unterschiedlich exprimierter Transkripte mit insgesamt 7260 Transkripten, die signifikante Veränderungen in den Expressionsniveaus zeigten44. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die in vitro kultivierten BY-2-Zellen sehr empfindlich auf Veränderungen in ihrer Umgebung reagieren. Sie können eine signifikante Reaktion auf äußere Reize wie die Zusammensetzung des Mediums und die MeJA-Behandlung auslösen.

Die beobachteten DEGs, einschließlich der in den Transkriptomdaten herunter- und hochregulierten (Ergänzungstabelle S5, S6), zeigen deutlich, dass stickstoffarme SH-Medien großen Einfluss auf eine Vielzahl von Zellstrukturen, Zellprozessen und Stoffwechselwegen hatten. Offensichtlich induzierten in SH-Medium kultivierte BY-2-Zellen im Vergleich zu MS-Medium Stress, was zu einer erheblichen Herunterregulierung der Expression von Strukturproteinen der Zellwand (z. B. vegetatives Zellwandprotein gp1, prolinreiches und glycinreiches Protein) führte. Der Stickstoffmangel führte auch zu einer verminderten Expression von Osmotin-ähnlichem Protein, das unter Stressbedingungen eine wichtige Rolle im pflanzlichen Immunsystem spielt, sowie von mehreren Proteasen und zellwandmodifizierenden Enzymen. Es ist erwähnenswert, dass eine Pektinhydrolase, Polygalacturonase, im SH-Medium am stärksten herunterreguliert wurde (Ergänzungstabelle S5). Pektin gilt als „Kleber“ zwischen zwei Zellen in Pflanzenzellen, wobei die pektinreiche Mittellamelle die Zell-Zell-Adhäsion vermittelt45. Daher könnte eine Herunterregulierung des Pektin-hydrolysierenden Enzyms Polygalacturonase für die beobachtete Verklumpung von in SH-Medium kultivierten BY-2-Zellen verantwortlich sein. Andererseits deutet die erhebliche Hochregulierung der Expression von Alkanhydroxylase MAH1-like, Dirigent Protein 23-like und Superoxiddismutase usw. auch darauf hin, dass die Pflanzenzellen auf irgendeine Form von Stress reagieren und dies auch versuchen Passt sich seiner Umgebung an, um zu überleben und zu gedeihen. Unsere Ergebnisse stimmen mit einigen anderen Studien überein, die die Auswirkungen von Stickstoffmangel auf verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen untersuchen. Beispielsweise haben Rivai et al. (2021) fanden heraus, dass Sorghumsämlinge, die in stickstoffarmen Medien gezüchtet wurden, signifikante Veränderungen in der Zellwand und ihren modifizierenden Genen aufwiesen, basierend auf RNAseq- und RT-qPCR-Daten46. Außerdem wurde festgestellt, dass ein Stickstoffmangel bei Gurkensämlingen die Zellwandumgestaltung beeinflusst47, und ein Mangel an Maiswurzeln im Entwicklungsstadium veränderte verschiedene biologische Regulationen stark, darunter Proteinmodifikation, Proteinabbau, Signaltransduktion und hormonelle Regulation48.

In Anbetracht der Tatsache, dass Hydroxylase und Glykosyltransferasen eine wichtige Rolle bei der Hyp-O-Glykosylierung und der anschließenden Sekretion von HypGP-markierten rekombinanten Proteinen spielen, wurden die Expressionsprofile der für diese Enzyme kodierenden Gene untersucht (ergänzende Abbildung S3). Während die Gene, die für die P4H- und Hyp:GlaT-Isoformen kodieren, im SH-Medium keine konsistente Expressionsregulierung zeigten, waren alle fünf Gal:GalT-Isoformen-Gene erheblich hochreguliert. Dieser Befund steht im Einklang mit dem zuvor vorgeschlagenen zweistufigen Hyp-O-Glykosylierungsmodell. In diesem Modell könnten die Hydroxylierung von Pro und die Addition der ersten Galaktose an den Hyp-Rest in ER, die durch die Enzyme P4H bzw. Hyp:GlaT katalysiert werden, ein unabhängiger und hocheffizienter Vorgang sein. Die anschließende Erweiterung des Galactose-Rückgrats, die die Hinzufügung weiterer Galactose-Reste zur Hyp-verknüpften Galactose einschließt und durch das Gal:GalT-Enzym ausgelöst wird, umfasst jedoch einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt49,50,51.

Die GO-Analyse trug dazu bei, die biologischen Prozesse hervorzuheben, die hauptsächlich an der Reaktion auf das Stickstoffmangel-SH-Medium beteiligt sind. Wie in Abb. 9A zu sehen ist, waren die hochregulierten Gene in der zellulären Reaktion auf mikrotubulibasierte Bewegungen und Prozesse, die Bewegung von Zellen und Zellkomponenten, den stressbasierten Proteasomkomplex, die Mikrotubuli- und Tubulinbindung sowie die motorische Aktivität der Mikrotubuli deutlich überrepräsentiert. Mikrotubuli sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts pflanzlicher Zellen, das an verschiedenen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Zellverlängerung und Organellenbewegung beteiligt ist52. Die Hochregulierung von Genen, die an der Mikrotubuli-basierten Bewegung und der Mikrotubuli-Motoraktivität beteiligt sind, legt nahe, dass die BY-2-Zellen auf die SH-Mediumumgebung reagierten, indem sie ihr Zytoskelett veränderten, um den Nährstoffmangel auszugleichen. Obwohl Mikrotubuli für den Proteintransport vom ER zum Golgi-Komplex nicht notwendig sind, können sie, sofern vorhanden, die Bewegung von Transportträgern vom ER zum Golgi-Komplex erleichtern53. Daher trugen die deutlich hochregulierten Gene, die mit der auf Mikrotubuli basierenden Bewegung und der Mikrotubuli- und Tubulinbindung verbunden sind, vermutlich zum verstärkten ER-zu-Golgi-Transport von HypGP-markierten Proteinen und anderen Proteinen in in SH-Medium gezüchteten BY-2-Zellen bei, was dazu führte Hyp-O-Glykosylierung von Proteinen in Golgi und anschließende extrazelluläre Sekretion. Die GO- und KEGG-Analyse zeigte auch die erhebliche Herunterregulierung der Gene, die mit der Proteinsynthese in in SH-Medium kultivierten BY-2-Zellen verbunden sind, einschließlich RNA-Spleißen, mRNA-Verarbeitung, Biosynthese aromatischer Aminosäuren, Ribosom, Spleißosomenkomplex, Translationsinitiationsfaktor-3-Komplex usw. und die Aktivitäten mehrerer Enzyme wie saure Phosphatase und Carbonsäureesterhydrolase (Abb. 9B), die vermutlich für das beobachtete verringerte Pflanzenzellwachstum im SH-Medium verantwortlich waren.

Aufgrund der großen Anzahl von DEGs, die in in SH-Medium gezüchteten BY-2-Zellen im Vergleich zu MS-Medium nachgewiesen wurden, konnte die Transkriptomanalyse keine direkte Erklärung für die beobachtete Wirkung der Medien auf den intrazellulären Transport und die Hyp-O-Glykosylierung liefern HypGP-markierte Proteine. Allerdings liefern die Transkriptomdaten wertvolle Einblicke in die zelluläre Reaktion von BY-2-Zellen auf Veränderungen in der Mediumzusammensetzung. Diese Ergebnisse unterstreichen die Empfindlichkeit von BY-2-Zellen gegenüber ihrer Kulturumgebung und legen nahe, dass die Zusammensetzung des Mediums einen erheblichen Einfluss auf das Zellwachstum und die Produktion/Sekretion rekombinanter Proteine haben kann. Zukünftige Studien könnten sich auf die Untersuchung spezifischer Gene und Signalwege konzentrieren, die an diesen Prozessen beteiligt sind, um ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen, die den Reaktionen von Pflanzenzellen auf Stickstoffmangel zugrunde liegen.

Der intrazelluläre Transport und die Hyp-O-Glykosylierung von HypGP-markierten Proteinen (EGFP und SCF) in BY-2-Zellen wurden stark vom Kulturmedium beeinflusst. Es wurde festgestellt, dass das Vorhandensein synthetischer HypGP-Tags wie (SP)32 und (AP)20 den Austritt des Fusionsproteins aus dem ER im MS-Medium behindert, was zur Bildung von PBs-ähnlichen Aggregaten führt. Im Gegensatz dazu erleichterte das SH-Medium den effizienten Transport von HypGP-markierten Proteinen zum Golgi, was die Hyp-O-Glykosylierung und die anschließende dramatische Sekretion ermöglichte. Die Transkriptomanalyse ergab eine große Anzahl von DEGs (über 16.000) in BY-2-Zellen, die in SH-Medium gezüchtet wurden, im Vergleich zur MS-Mediumkontrolle, wobei viele hochregulierte DEGs mit mikrotubulibasierter Bewegung, Bewegung von Zellen oder subzellulären Komponenten und Mikrotubulibindung verbunden waren. Diese DEGs waren vermutlich für den verstärkten ER-Golgi-Transport von HypGP-markierten Proteinen für die anschließende Glykosylierung und Sekretion verantwortlich. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen die Notwendigkeit weiterer Forschung zum Einfluss der Mediumzusammensetzung auf die Produktion/Sekretion rekombinanter Proteine in Pflanzenzellkulturen, was letztendlich zur Entwicklung effizienterer und kostengünstigerer Proteinexpressionssysteme führen könnte. Darüber hinaus verbessert diese Studie auch unser Verständnis des intrazellulären Transports und des Hyp-O-Glykosylierungsprozesses von Pflanzenzell-Glykoproteinen in Pflanzenzellen, da die HypGP-Tags, einschließlich (SP)32 und (AP)20, die Signaturmodule von Arabinogalactan sind Glykoproteine in der pflanzlichen Zellwand.

Transformierte BY-2-Zellen, die die EGFP-Kontrolle (SP)32-EGFP und (AP)20-EGFP exprimieren, werden alle durch den Promotor des 35S-Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S) und eine Tabak-Extensin-Signalpeptidsequenz (SStob) vorangetrieben (Abb. 10). ) wurden früher erstellt9,15. Das humane Stammzellfaktor-Gen (SCF) wurde durch PCR aus der Vorlage pBI121-SCF-(SP)209 amplifiziert und an den XmaI- und BsrGI-Stellen in pBI121-SStob-(SP)32-EGFP20 subkloniert, um pBI121-SStob-( SP)32-SCF (Abb. 10). Der Vektor wurde mit der Gefrier-Auftau-Methode in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 übertragen und dann mit der Agrobacterium-vermittelten Methode stabil in BY-2-Zellen transformiert54. Die Tabak-BY-2-Zellen wurden aus dem Labor von Dr. Marcia Kieliszewski an der Ohio University (Athen, OH, USA) bezogen. Transformierte BY-2-Zellkolonien wurden durch 100 µg/ml Kanamycin selektiert. Der durch pFGC-Man49-mCherry kodierte Golgi-Marker und der durch pFGC-mCherry-HDEL55 kodierte ER-Marker wurden von der Arabidopsis Information Resource (TAIR) (Columbus, OH) bezogen. Jeder von ihnen wurde für die subzelluläre Kolokalisationsanalyse stabil in die BY-2-Zelllinie transformiert, die (SP)32-EGFP oder EGFP-Kontrolle exprimiert. Transformierte Zellkolonien wurden durch 5 µg/ml Bialaphos selektiert. Die gesamte Forschung mit rekombinanter DNA und transgenen Pflanzenzellen entsprach den NIH-Richtlinien für Forschung mit rekombinanten oder synthetischen Nukleinsäuremolekülen und folgte dem Protokoll, das von den Institutional Biosafety Committees (IBCs) der Arkansas State University genehmigt wurde (Genehmigungsnummer: 95565- 4).

Schematische Darstellung der im pBI121-Expressionsvektor klonierten Genkonstrukte. SStob-Tabak-Extensin-Signalsequenz; (SP)32 32 Tandemwiederholungen eines „Ser-Pro“-Motivs; (AP)20 20 Tandemwiederholungen eines „Ala-Pro“-Motivs; SCF-Faktor menschlicher Stammzellen; CaMV35S 35S Blumenkohlmosaikvirus-Promotor; Pnos-Nopalin-Synthase-Promotor; Tnos-Nopalin-Synthase-Terminator; nptII Neomycin-Phosphotransferase II.

Transformierte BY-2-Zellen wurden in einem SH-Medium gehalten, das aus 3,2 g/L SH-Basalsalzmischung (PhytoTech Labs, St. Lenexa, KS), 2,1 mg/L p-Chlorphenoxyessigsäure und 0,4 mg/L 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure bestand Säure (2,4-d), 0,1 mg/L Kinetin und 34 g/L Saccharose, oder MS-Medium bestehend aus 4,3 g/L MS-Basalsalzmischung (PhytoTech Labs), 0,18 g/L KH2PO4, 100 mg/L Myoinositol, 1 mg/L Thiamin, 0,44 mg/L 2,4-d und 30 g/L Saccharose. Für die Suspensionskultur wurden BY-2-Zellen in 250-ml-Schüttelkolben mit 80 ml flüssigem Medium gezüchtet und bei 95 U/min unter kontinuierlicher Beleuchtung bei Raumtemperatur (22–24 °C) rotiert. Jede Woche wurden Subkulturen mit einer Inokulumdichte von 5 % (v/v) durchgeführt. Kultivierte Zellen wurden durch Vakuumfiltration geerntet. Anschließend wurden die Zellen 48 Stunden lang in einem Ofen bei 70 °C getrocknet und gewogen, um das Trockengewicht (DW) zu bestimmen. Der Zellbiomasseertrag wurde in Gramm Zelltrockengewicht pro Liter Medium (gDW/L) ausgedrückt.

Die Kulturmedien wurden direkt für den Western-Blot-Assay verwendet. Intrazelluläre Proteine wurden durch Mahlen von ca. 0,5 g Zellen (Frischgewicht) in flüssigem Stickstoff extrahiert und anschließend mit SDS-Extraktionspuffer (Natriumdodecylsulfat)10 im Verhältnis 1:2 (Gew./Vol.) ergänzt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 × g zentrifugiert und die Überstände gesammelt. Für den Western-Blot-Assay wurden Proteinproben auf einem 4–20 % vorgefertigten Tris-HCl-Gel (Bio-Rad, Hercules, CA) aufgetrennt und dann auf eine 0,2 μm Nitrozellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA) elektrogeblottet. . Protein-Blots wurden mit 3 % (Gew./Vol.) BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5) mit 0,1 % Tween® 20 blockiert. Rekombinante EGFP- und SCF-Produkte wurden unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-EGFP-Antikörpers (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) und ein polyklonaler Kaninchen-anti-SCF-Antikörper (ThermoFisher Scientific) als primärer Antikörper und ein Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H + L)-Peroxidase-konjugiertes (Jackson Immuno Research labs, West Grove, PA) als sekundärer Antikörper. Anschließend wurden Proteinblots mit dem SuperSignal® West Pico Chemilumineszenzsubstrat (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA) nachgewiesen. Die Blot-Bilder wurden entweder mit dem Bildgebungssystem Li-Cor Odyssey Fc (Li-Cor Biosciences, NE) aufgenommen oder einem Röntgenfilm ausgesetzt.

Die konfokale Bildgebung der in SH- oder MS-Medium gezüchteten BY-2-Zellen wurde mit einem konfokalen Nikon D-Eclipse C1-Laserscanning-Kopf durchgeführt, der an einem Nikon Eclipse E800-Mikroskop mit entweder einem 40 × /0,8 W Nikon Fluor-Wasserimmersionsobjektiv oder einem Nikon Fluor-Wasserimmersionsobjektiv montiert war 100×/0,8 W Nikon Fluor Ölimmersionsobjektiv. Die Fluoreszenz der Zellen wurde bei den folgenden Wellenlängen nachgewiesen: 488-nm-Anregung mit einem 525/50-nm-Filter für EGFP-Fluoreszenz und 543-nm-Anregung mit einem 595/50-nm-Filter für RFP-Fluoreszenz.

BY-2-Zellen, die (SP)32-EGFP und EGFP exprimieren, wurden 8 Tage lang in SH-Medium kultiviert, um die mittlere exponentielle Wachstumsphase zu erreichen. Anschließend wurden die Kulturen mit BFA auf eine Endkonzentration von 10 µg/ml ergänzt, wie bereits beschrieben56, und 1, 2 und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Assay untersucht wurden.

Drei biologische Replikate von BY-2-Zellen (Wildtyp oder (SP)32-EGFP-Linie), die in SH- und MS-Medien gezüchtet wurden, wurden nach 8 Tagen Subkultur gesammelt. Die Gesamt-RNA wurde mit dem PureLink™ RNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die Konzentration der RNA wurde mit dem NanoDrop™ OneC Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) bestimmt. Die RNA-Integrität wurde mit dem RNA Nano 6000 Assay Kit des Bioanalyzer 2100-Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) bewertet.

Eine einstufige RT-qPCR wurde mit dem SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit (Invotrogen, Carlsbad, CA) im Bio-Rad CFX384-Instrument (Hercules, CA, USA) durchgeführt. Die Normalisierung wurde mit drei Housekeeping-Genen durchgeführt, darunter β-Actin, Elongationsfaktor 1α (EF-1α) und ribosomales L25-Protein (L25), wie bereits berichtet57. Das Expressionsniveau des (SP)32-EGFP- und (SP)32-SCF-Gens sowie vier weiterer endogener Gene: Alkanhydroxylase MAH1-like (LOC107798865), Laccase-15-like (LOC107829253), Polygalacturonase (LOC107824442) und vegetativ Zellwandprotein gp1-like (LOC107802007) wurden bewertet. Alle für RT-qPCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S7 aufgeführt. Qualitäts- und Datenanalyse wurden in der Bio-Rad CFX Maestro-Software unter Verwendung der 2(−ΔΔCt)-Methode durchgeführt und die Ergebnisse für jedes Gen wurden als 2(−ΔΔCt)-Werte relativ zum Mittelwert der Kontrollgruppe ausgedrückt.

Die Proben mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) ≥ 7 wurden für den Aufbau, die Sequenzierung und die Datenanalyse der cDNA-Bibliothek von Novogene Corporation Inc. (Tianjin, China) weitergegeben. Ungefähr 1,0 µg RNA pro Probe wurden als Inputmaterial für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek unter Verwendung des NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit für Illumina® (New England Biolabs, Ipswich, MA) verwendet. Kurz gesagt, Poly(A)+-mRNA wurde aus der Gesamt-RNA-Probe unter Verwendung von Oligo(dT)-Magnetkügelchen isoliert und mit zweiwertigen Kationen weiter fragmentiert. Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung eines zufälligen Hexamer-Primers und M-MuLV-Reverse-Transkriptase synthetisiert, gefolgt von der Synthese der Zweitstrang-cDNA unter Verwendung von DNA-Polymerase I. Cluster aus indexkodierten Proben wurden auf einem cBot-Cluster-Generierungssystem mit erzeugt PE-Cluster-Kit cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Nach dem Clustering wurden die Bibliotheksvorbereitungen auf einer HiSeq2500 Illumina-Plattform sequenziert und Paired-End-Reads generiert. Die Sequenzierungsdaten wurden in das NCBI Sequence Read Archive (Zugangsnummer: PRJNA931284) hochgeladen.

Die Qualitätskontrolle der Rohdaten von RNA-Seq im FASTQ-Format wurde mit dem Fastp-Tool durchgeführt. Die sauberen Lesevorgänge wurden mithilfe der HISAT2-Software dem Referenzgenom von Nicotiana tabacum (Ntab-TN90, GenBank-Zugangsnummer: SAMN02316627) zugeordnet. Die Häufigkeit der Genexpression wurde mithilfe von FeatureCounts quantifiziert. Die unterschiedliche Expression zwischen den in SH-Medium und MS-Medium (Kontrolle) kultivierten Zellen wurde mit dem DESeq2 R-Paket analysiert. Gene mit einem durch DESeq2 gefundenen angepassten P-Wert <0,05 wurden als differentiell exprimierte Gene (DEGs) zugeordnet, die einer funktionellen Anreicherungsanalyse unterzogen wurden. Die Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse von DEGs wurde durch das ClusterProfiler R-Paket implementiert, um Gene in drei Kategorien zu klassifizieren: molekulare Funktionen, zelluläre Komponenten und biologische Prozesse. GO-Terme mit einem korrigierten P-Wert <0,05 wurden als durch DEGs signifikant angereichert angesehen. Darüber hinaus wurde das ClusterProfiler R-Paket für die Pfadanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verwendet, um Anreicherungspfade mit demselben Cutoff-Wert wie die GO-Anreicherungsanalyse zu identifizieren.

Tests der Biomasse- und sekretierten Proteinausbeuten wurden mit drei Replikaten durchgeführt und die Daten werden als Mittelwert mit begleitender Standardabweichung (SD) dargestellt. Eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Post-hoc-Bereichstest nach Tukey wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Behandlungen zu bestimmen, bei denen p < 0,05 als signifikant angesehen wurde.

Die während der aktuellen Studie generierten RNA-Sequenzierungsdaten sind im NCBI Sequence Read Archive (Zugangsnummer: PRJNA931284) verfügbar. Alle anderen Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom Arkansas IDeA Network of Biomedical Research Excellence – Research and Development Grant (Grant-Nr. P20GM103429), der National Science Foundation (Grant-Nr. 1605564), dem National Institute of Health (Grant-Nr. R15DK128757) und dem unterstützt Arkansas Biosciences Institute, die wichtigste Forschungskomponente des Arkansas Tobacco Settlement Proceeds Act von 2000.

Arkansas Biosciences Institute, Arkansas State University, Jonesboro, AR, 72401, USA

Uddhab Karki, Sankalpa Chakraborty, Ningning Zhang und Jianfeng Xu

Programm für Molekulare Biowissenschaften, Arkansas State University, Jonesboro, AR, 72401, USA

Uddhab Karki, Sankalpa Chakraborty, Ningning Zhang und Jianfeng Xu

Abteilung für Biowissenschaften, Arkansas State University, Jonesboro, AR, 72401, USA

Paula Perez Sanchez, Berry Dickey und Jacqueline Vargas Ulloa

College of Agriculture, Arkansas State University, Jonesboro, AR, 72401, USA

Jianfeng Xu

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JX und UK konzipierten und gestalteten die Forschung. UK, PP, SC, BD, NZ und JX führten Experimente durch. JX, UK und JV analysierten Daten. JX, UK und PP haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jianfeng Xu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 10. April 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 19. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40723-3

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Intrazellulärer Transport und Glykosylierung von Hydroxyprolin