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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1976 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wir untersuchten die physiologische und transkriptomische Reaktion von Escherichia coli in der frühen stationären Phase auf Leuchtdioden mit unterschiedlichen Wellenlängen. Das Wachstum und die Stoffwechselveränderungen von E. coli O157:H7 wurden unter dem Einfluss von beleuchtetem Licht mit 465, 520 und 625 nm untersucht. Unter 465-nm-Beleuchtung war das Wachstum von E. coli O157:H7 im Vergleich zu 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung und unbeleuchteter Kontrolle deutlich verzögert. Stoffwechselveränderungen wurden unter diesen Beleuchtungs- und unbeleuchteten Bedingungen auf der Grundlage transkriptomischer Messungen untersucht. Die transkriptomische Reaktion unter 520 nm und 625 nm blieb nahezu ähnlich der Kontrolle, mit Ausnahme einiger hoch- und herunterregulierter Gene. Die transkriptomischen Messwerte des Kohlenhydratstoffwechsels waren unter 465-nm-Beleuchtung im Vergleich zu 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung und unbeleuchteter Kontrolle stark herunterreguliert, was zeigt, dass Glukose als einzige Energiequelle während der exponentiellen Phase erschöpft ist. Der Abbau von Fettsäuren, beispielsweise in Genen, die mit Fad-Regulon in Zusammenhang stehen, wurde in Zellen unter 465-nm-Beleuchtung hochreguliert, was die Umstellung der Zellen auf die Nutzung von Fettsäuren als neue Kohlenstoffenergiequelle während der frühen stationären Phase offenbarte. Die Exposition von E. coli O157:H7-Zellen gegenüber 465 nm beleuchtetem Licht regulierte Virulenzfaktorgene wie hlyA, hlyB, hlyC, stx1A, stx2B, paa und bdm herunter. Unter dem Stress der 465-nm-Beleuchtung wurde die Expression von Stress- und Flagellenmotilitäts-bezogenen Genen hochreguliert, was zu einem Energieverbrauch und einer Verringerung des Zellwachstums führte. Außerdem wurden die oxidativ phosphorylierten transkriptomischen Messwerte unter 465-nm-Beleuchtung hochreguliert, wahrscheinlich aufgrund der Produktion von ROS, die zu einer Verringerung des Zellwachstums während der frühen stationären Phase führen könnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass pathogene E. coli O157:H7 unterschiedlich auf eine andere Wellenlänge der in dieser Studie verwendeten Leuchtdioden reagieren.

Die Produktion von Zimmerpflanzen mit künstlichen Leuchtdioden ist heutzutage von großem Interesse im Hinblick auf die Produktion von Bio-Gemüse in einer sauberen, präzise kontrollierten Umgebung und im Kampf gegen Landressourcen und Umweltfaktoren1. Verschiedene Gemüsesorten wie Tomaten, Kartoffeln, Chilis, Kohl und Salat wurden erfolgreich in Indoor-Fabriken angebaut1. Licht, Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Luft und Ernährung sind die wichtigsten Faktoren für das Pflanzenwachstum. Zimmerpflanzenfabriken unter kontrollierten Umgebungen haben im Vergleich zum traditionellen Gartenbau ein höheres Produktionspotenzial und Vorteile. Es wurde bereits berichtet, dass der Klimawandel zu großen Verlusten bei der Lebensmittelproduktion führt2,3. Darüber hinaus wirkt sich der Klimawandel mit Naturkatastrophen negativ auf die Produktion wichtiger landwirtschaftlicher Nutzpflanzen aus, wie z. B. die Maisanbauproduktion im Nordosten Chinas, die von 1997 bis 2017 um die Hälfte zurückgegangen ist4. Es wird geschätzt, dass diese extremen Wetterveränderungen zu schwerer Nahrungsmittelknappheit und Hunger für 170 Menschen führen können Millionen Menschen bis 20805,6.

Um der Nahrungsmittelknappheit zu begegnen, gilt die Pflanzenproduktion in Innenräumen als beste Alternative, die künstliches Licht für die Photosynthese der Pflanzen benötigt. Unter den künstlichen Lichtern gelten Leuchtdioden (LED) als die beste Option, da sie mehrere Vorteile haben, wie z. B. das Fehlen von Quecksilber-Niederdrucklampen (LPM), geringe Größe, lange Lebensdauer, nicht thermisch und können auch effizient zur Steigerung der Nährwerte eingesetzt werden. und Kontrolle der Mikrobenpopulation in Pflanzen und Gemüse7,8. Die Wirkung von LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen wurde bereits zuvor untersucht, um ihre Wirkung auf Gemüse und Obst zu untersuchen. Beispielsweise waren 660-nm-LEDs für die überwiegende Anreicherung von Carotinoid (β-Cry) in Satsuma-Mandarinen wirksam9. Darüber hinaus erhöhten blaue (465 nm) und rote (625 nm) LEDs an Erbsensämlingen die Chlorophyll- und β-Carotin-Konzentration10.

Die Produktion frisch geschnittener Produkte ist in Korea im letzten Jahrzehnt auf 64,8 % gestiegen11. In ähnlicher Weise floriert auch die Branche der Kochboxen weltweit. Im Jahr 2017 wurde in den Vereinigten Staaten (USA) ein Wachstum von 300 % im Wert von 4,65 Milliarden US-Dollar verzeichnet11. Sowohl frisch geschnittene Produkte aus Zimmerpflanzenfabriken als auch Essenssets enthalten verschiedene Gemüsesorten, die normalerweise ohne Verarbeitung verzehrt werden. Escherichia coli O157:H7 gilt als der häufigste Krankheitserreger in Frischprodukten und verursacht beim Menschen Krankheiten wie hämorrhagische Kolitis, blutigen Durchfall und das hämolytisch-urämische Syndrom12. Von 2008 bis 2020 wurden in den USA, im Vereinigten Königreich (UK) und in Kanada insgesamt 515, 165 bzw. 235 Fälle von lebensmittelbedingten Ausbrüchen bei Frischprodukten aufgrund enterohämorrhagischer E. coli (EHEC) gemeldet13,14,15 . Bisher wurde kein Ausbruch in den Zimmerpflanzenfabriken gemeldet, doch mit der Weiterentwicklung und der Notwendigkeit von Zimmerpflanzenfabriken ist auch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination von Gemüse durch E. coli O157:H7 gestiegen.

Um durch Lebensmittel übertragene Krankheiten, insbesondere die Inaktivierung von E. coli O157:H7 in frischen Produkten, zu reduzieren, ist ein Desinfektionsschritt unerlässlich. Das Waschen von Babyblättern, Gemüse oder Beerenfrüchten könnte aufgrund ihrer fragilen Struktur ihre Form und ihr Aussehen verändern und würde zum Verlust ihres kommerziellen Wertes führen. Frische Produkte könnten ohne Waschschritte nach der Nacherntezeit ein starkes mikrobielles Wachstum aufweisen16,17. Eine Methode zur Abtötung von Mikroben ist die Verwendung von ultraviolettem (UV) Licht mit LPM, das die DNA-Replikation stört und zum Zelltod von Mikroben führt18. Aufgrund der schwerwiegenden physikalischen und chemischen Gefahren wird die UV-Bestrahlung in der Lebensmittelindustrie jedoch nicht empfohlen19. LED erweist sich als potenzielle Alternative zu anderen Behandlungen und zur Verwendung bei der Oberflächenbehandlung von Frischwaren. Studien haben gezeigt, dass UV-LEDs das mikrobielle Wachstum in verschiedenen Obst- und Gemüseprodukten kontrollieren können20. Basierend auf der Zusammensetzung und dem Halbleitermaterial können LEDs so gestaltet werden, dass sie die gewünschte Wellenlänge abstrahlen19. Die antibakterielle Wirkung von LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen gegen lebensmittelbedingte Krankheitserreger wurde untersucht und es wurde festgestellt, dass blaue (461 nm) und grüne (521 nm) LEDs diese Krankheitserreger wirksam bekämpfen21,22.

Die Hemmwirkung von LEDs unterschiedlicher Wellenlänge gegen E. coli O157:H7 wurde bereits zuvor an Frischprodukten untersucht23. Studien zeigten, dass intrazelluläre Moleküle in Bakterien Lichtwellenlängen absorbieren, die ihr Wachstum beeinflussen22. Über Veränderungen der Genomexpression basierend auf transkriptomischen Sequenzen von E. coli O157:H7 unter Behandlung mit unterschiedlichen Wellenlängen wurde jedoch bisher nicht berichtet. Transkriptomische Sequenzen liefern nützliche Einblicke, um die Veränderungen in den genomischen und metabolischen Merkmalen einer einzelnen Mikrobenart zu untersuchen und gleichzeitig verschiedene Umgebungen, einschließlich unterschiedlicher Wellenlängenstress, zu vergleichen. Daher untersuchten wir in dieser Studie das Wachstum von E. coli O157:H7 unter der Belastung durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge, extrahierten ihre gesamten RNAs und sequenzierten sie, um ihre Reaktion auf eine langfristige Exposition gegenüber blauer, grüner und roter LED zu verstehen Beleuchtung auf molekularer Ebene.

Es wurde festgestellt, dass drei verschiedene LEDs (blau, grün und rot) Intensitätsspitzen bei den Wellenlängen 465, 520 bzw. 625 nm aufweisen (Tabelle 1). Da eine LED-Beleuchtung über einen längeren Zeitraum die Temperatur des Wachstumsmediums erhöhen könnte, wurde die Temperatur von TSB während der LED-Beleuchtung 4 Stunden lang überwacht, um die optimale Temperaturbedingung für das Zellwachstum unter LED-Beleuchtung auszuwählen. Unabhängig von der Wellenlänge führte die LED-Beleuchtung zu einem Anstieg der TSB-Temperatur um etwa 0,5 °C im Vergleich zur eingestellten Temperatur des Inkubators (Daten nicht gezeigt). Daher wurde die Temperatur für das Zellwachstum unter LED-Beleuchtung auf 24,5 °C eingestellt, um den Temperatureffekt auf das Zellwachstum zu eliminieren.

Die durchschnittlichen Wachstumskurven für E. coli O157:H7-Zellen, die unter dunklen Bedingungen oder unter jeder LED-Beleuchtung gezüchtet wurden, angepasst an das Baranyi-Modell (Abb. 1). Das Bestimmtheitsmaß (R2-Werte) für die angepassten Wachstumskurven war größer als 0,99 (Daten nicht gezeigt). Das Wachstumsmuster von E. coli O157:H7 wurde durch LED-Beleuchtung mit unterschiedlichen Wellenlängen verändert. Das Zellwachstum unter dunklen Bedingungen (Kontrolle) ähnelte dem von 520 nm, während sich die Wachstumsmuster der Zellen während der LED-Beleuchtung mit 465 und 625 nm von denen der Kontrollzellen in TSB bei 25 °C unterschieden. Die Wachstumsparameter von nicht- und LED-beleuchtetem E. coli O157:H7 wurden anhand der angepassten Wachstumskurven berechnet (Tabelle 2). Es gab keine signifikanten (P < 0,05) Unterschiede in den LPD-Werten zwischen der Kontrolle und 520 nm bzw. der Kontrolle und 625 nm, wohingegen Zellen, die unter 465-nm-Beleuchtung gezüchtet wurden, längere Verzögerungsphasen aufwiesen als die anderen. In ähnlicher Weise wurden bei Zellen, die unter 465-nm-Beleuchtung gezüchtet wurden, ein niedrigerer GR und ein höherer DT beobachtet als bei Kontrollzellen. Darüber hinaus erreichten Zellen unter 465-nm-Beleuchtung einen deutlich (P < 0,05) niedrigeren MPD im Vergleich zur Kontrolle. Im Gegensatz zu 465 nm werden unter 625-nm-Beleuchtung keine signifikanten Unterschiede in den DT- und MPD-Werten zwischen der Kontrolle und den Zellen gezüchtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Zellwachstum durch die 465-nm-LED-Beleuchtung stark beeinflusst wurde, während dies bei LEDs anderer Wellenlängen nicht der Fall war. Auf der Grundlage der Wachstumskurven wurde die frühe stationäre Phase für unbeleuchtete Kontrollzellen und Zellen unter 625-nm-Beleuchtung mit 17 Stunden bestimmt, während sie für Zellen unter 520-nm- bzw. 465-nm-Beleuchtung nach 18 Stunden und 29 Stunden erreicht wurde . Die gesammelten Zellen in der frühen stationären Phase wurden einer RNA-Seq-Analyse unterzogen.

Wachstumsüberleben von E. coli O157:H7 unter dem Einfluss von Licht verschiedener Wellenlängen. Als Kontrolle diente das Zellwachstum unter dunklen Bedingungen.

Die PCA wurde durchgeführt, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede der transkriptomischen Messwerte zwischen Proben unter Beleuchtung und Kontrolle bei 465, 520 und 625 nm zu untersuchen (Abb. 2A). Die maximalen Genvariationen in diesen 4 Gruppen betrugen 56,8 % (PC1) und 33,3 % (PC2) mit einer akzeptablen Trennung und Clusterbildung, was zeigt, dass die Gene von E. coli O157:H7 bei 465 nm, 520 nm und 625 nm unterschiedlich reagierten Beleuchtung und Steuerung. Darüber hinaus lagen die transkriptomischen Messwerte von Zellen, die unter 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung behandelt wurden, näher an denen der Kontrolle, während sie sich völlig von den transkriptomischen Messwerten von Zellen unterschieden, die unter 465-nm-Beleuchtung behandelt wurden, was zeigt, dass eine 465-nm-Beleuchtung große Transkriptomveränderungen in E. induzieren könnte. coli O157:H7-Zellen im Vergleich zu unbeleuchteten Kontrollzellen und 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung. Die DEGs unter Beleuchtungsbedingungen wurden auch mit der Kontrolle mit einer angepassten Faltungsänderung (FC) > 2 und P <0,05 verglichen (Abb. 2B). Unter 465-nm-LED-Beleuchtung wurde ein höherer Anteil an Genen überexprimiert (513 Gene) und unterexprimiert (495 Gene) im Vergleich zu 520 nm (88 hochregulierte; 62 herunterregulierte Gene) und 625 nm (13 hochregulierte Gene). reguliert; 15 herunterregulierte Gene) LED-Beleuchtung im Vergleich zur Kontrolle. Zusätzliche Genexpressionsniveaus unter 465-nm-Beleuchtung und -Kontrolle wurden verglichen und als Streudiagramme mit einem angepassten FC > 2 und P < 0,05 visualisiert (Abb. 2C). Das Streudiagramm zeigt die Bedeutung und Unterschiede bei transkriptomischen Lesevorgängen. Zusätzlich wurde die Transkriptionsreaktion von E. coli O157:H7 unter verschiedenen LED-Beleuchtungen bewertet (Tabelle 3). Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Hoch- oder Herunterregulierung von Genen in E. coli O157:H7-Zellen. Die höchste Anzahl von Genen, bei denen die Expression signifikant beeinträchtigt war, wurde nach der Exposition von E. coli O157:H7 bei 465-nm-LED-Beleuchtung verursacht. Bei der Kontrolle, 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung, stieg die Anzahl der Gene jedoch deutlich an herunterreguliert war ziemlich ähnlich. Die 465-nm-LED-Beleuchtung regulierte im Vergleich zur Kontrolle, 520 nm und 625, auch Gene im Zusammenhang mit Virulenzfaktoren (hlyA, hlyB, hlyC, hlyE, stx1A, stx2A, paa) und Flagellenproteinen (csgF, csgC, fimC, fimD) erheblich herunter nm LED-Beleuchtung.

Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Genexpression von E. coli O157:H7, behandelt unter verschiedenen Lichtwellenlängen. Als Kontrolle diente das Zellwachstum unter dunklen Bedingungen. Die Skalierung der Einheitsvarianz wird auf Zeilen angewendet. SVD mit Imputation wird zur Berechnung der Hauptkomponenten verwendet. Die X- und Y-Achse zeigen Hauptkomponente 1 und Hauptkomponente 2, die 56,8 % bzw. 33,3 % der Gesamtvarianz erklären. N = 4 Datenpunkte (A), Verteilung differentiell exprimierter Gene (DEGs). Die X-Achse ist der Vergleich verschiedener Gruppen (B, 465 nm; G, 520 nm; R, 625 nm; C, Kontrolle) und die Y-Achse ist die Anzahl der DEGs (B) und ein Streudiagramm zur Darstellung der Verteilung von DEGs. Die graue Farbe stellt Nicht-DEGs dar und entlang der X-Y-Achse verstreute Gene zeigen die Gene an, die unter blauem 465-nm-Licht und Kontrolle (C) im Überfluss vorhanden waren.

Um die Stoffwechseleigenschaften von E. coli O157:H7 zu untersuchen, wurde der Stamm unter LED-Beleuchtung und unbeleuchteten Bedingungen kultiviert und das Transkriptom analysiert. Die relativen Aktivitäten der funktionellen Gene wurden anhand der relativen Häufigkeit von E. coli O157:H7-mRNA-Reads aus der Gesamtzahl der mRNA-Reads von E. coli O157:H7 berechnet. Die mRNA-Reads von E. coli O157:H7 wurden funktionell jeder KEGG-Stoffwechselkategorie zugeordnet (Abb. 3). Die KEGG-Verteilungen der E. coli O157:H7-mRNA-Messungen unter 465-nm-LED-Beleuchtung unterschieden sich von der unbeleuchteten Kontrolle und der 520-nm- und 625-nm-LED-Beleuchtung. Die mRNA-Transkripte auf der Primärebene wurden unter allen vier Bedingungen überwiegend der Stoffwechselkategorie zugeordnet (Abb. 3A). Auf der sekundären Ebene wurden die mRNA-Transkripte bei unbeleuchteter Kontrolle und 520-nm- und 625-nm-LED-Beleuchtung überwiegend der Kategorie Kohlenhydratstoffwechsel zugeordnet, bei 465-nm-LED-Beleuchtung wurden die mRNA-Transkripte jedoch ebenso überwiegend der Kategorie Kohlenhydratstoffwechsel zugeordnet Kohlenhydratstoffwechsel und Übersetzungskategorien ebenfalls (Abb. 3B). Bei 465-nm-LED-Beleuchtung waren die mRNA-Werte für den Kohlenhydratstoffwechsel verringert, was zu einem verzögerten Wachstum von E. coli O157:H7 führte. Im Fall der unbeleuchteten Kontrolle und der Beleuchtung bei 520 nm und 625 nm wurden die zweithäufigsten mRNA-Messwerte der Membrantransportkategorie zugeordnet und waren deutlich höher als die mRNA-Messwerte unter 465 nm beleuchtetem E. coli O157:H7 (Abb. 3B). ). Im Fall der unbeleuchteten Kontrolle und der LED-Beleuchtung bei 520 nm und 625 nm wurden die zweithäufigsten mRNA-Messwerte der Kategorie Membrantransport zugeordnet und waren deutlich höher als die mRNA-Messwerte unter 465 nm LED-beleuchtetem E. coli O157:H7 ( Abb. 3B). Darüber hinaus zeigten mRNA-Messungen von E. coli O157:H7 auf tertiärer Ebene die Unterkategorien Kohlenhydratstoffwechsel und Umweltinformationsverarbeitung (Abb. 3C). Gene zur Verarbeitung von Umweltinformationen, die hauptsächlich an ABC-Transportern und dem PTS-Systemweg beteiligt sind, die am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind und auf Umweltsystembedingungen reagieren, wurden unter 465-nm-LED-Beleuchtung herunterreguliert. In fast allen Kategorien auf tertiärer Ebene waren die mRNA-Werte bei 465-nm-LED-Beleuchtung im Vergleich zur unbeleuchteten Kontrolle und bei 520-nm- und 625-nm-LED-Beleuchtung deutlich verringert.

Escherichia coli O157:H7-Transkriptionsexpression (RPKM, Lesezahlen pro Kilobase jeder kodierenden Sequenz, pro Million kartierter Lesevorgänge) repräsentativer KEGG-Funktionskategorien auf der primären (A), sekundären (B) und tertiären (C) Ebene, behandelt unter verschiedenen Wellenlängen Beleuchtung. Als Kontrolle diente das Zellwachstum unter dunklen Bedingungen.

Die Stoffwechselmerkmale von E. coli O157:H7 wurden weiter untersucht, indem die mRNA-Werte von Zellen unter verschiedenen LED-beleuchteten und unbeleuchteten Lichtern den KEGG-Signalwegen zugeordnet wurden (Abb. 4). Die metabolische Transkriptomanalyse von KEGG zeigte, dass einige Stoffwechselwege von E. coli O157:H7 unter 465-nm-LED-Beleuchtung ebenfalls hochreguliert waren, beispielsweise diejenigen, die an der Translation und dem Energiestoffwechsel beteiligt sind. Allerdings wurden viele andere Gene, wie etwa Stoffwechselwege, die am Kohlenhydratstoffwechsel und Membrantransport beteiligt sind, im Vergleich zur unbeleuchteten Kontrolle und bei 520-nm- und 625-nm-LED-Beleuchtung herunterreguliert. Eine Vielzahl transkriptomischer Messwerte im Zusammenhang mit oxidativer Phosphorylierung (Abb. 5A), Fettsäureabbau (Abb. 5B) und Flagellenanordnung (Abb. 5C) wurden in Zellen unter 465-nm-LED-Beleuchtung im Vergleich zu transkriptomischen Messwerten von E. hochreguliert . coli O157:H7 unter unbeleuchteter Kontrolle. Beispielsweise wurden bei der oxidativen Phosphorylierung die Gene nuoA bis nuoN, die für eine NADH kodieren: Ubiquinon-Oxidoreduktase hochreguliert, jedoch wurden die für den Cytochrom-O-Oxidase-Komplex kodierenden Gene cyoBCDE herunterreguliert, wenn Zellen einer 465-nm-LED-Beleuchtung ausgesetzt wurden. Mehrere Dehydrogenase-Gene wurden ebenfalls herunterreguliert, wenn sie einer 465-nm-LED-Beleuchtung ausgesetzt wurden, beispielsweise die für Succinatdehydrogenase kodierenden Gene sdhABCD und die für Fumaratreduktase kodierenden Gene frdABCD. Diese Gene sind an der Reduktion von Ubiquinon zu Ubiquinol beteiligt, das ein Elektron an terminale Oxidasen, Cytochrom o oder die Cytochrom d-Komplexe abgibt, die Ubiquinol oxidieren und molekularen Sauerstoff zu Wasser reduzieren. Die Herunterregulierung der Komponenten der Elektronentransportkette (ETC) zeigte, dass Zellen unter 465-nm-Beleuchtung im Vergleich zu nicht beleuchteten gesunden Kontrollzellen nicht gesund genug für die aerobe Atmung waren (Abb. 5A). Es scheint, dass Zellen Fettsäuren als einzige Kohlenstoff- und Energiequellen mit verschiedenen Ketten verbrauchen. E. coli-Zellen nehmen Fettsäuren auf und bauen sie über den β-Oxidationsweg ab oder nutzen Fettsäuren für die Biosynthese von Membranphospholipiden. Das Enzym Fad Regulon ist an der Katalyse dieser Abbauwege beteiligt, die langkettige Fettsäuren aktivieren und transportieren und zu Acetyl-CoAs abbauen (Tabelle 3, Abb. 5B). In der vorliegenden Studie wurden die Gene fadL, fadJ, fadI, fadH, fade und fadD, die an der Acetyl-CoAs-Produktion beteiligt sind, unter 465-nm-LED-Beleuchtung im Vergleich zu signifikant auf 6,12, 6,53, 5,64, 3,05, 4,97 bzw. 5,73 log2 hochreguliert 520 nm (4,75, 4,85, 4,11, 0,41, 3,41 bzw. 4,10 log2) und 625 nm (5,28, 5,22, 4,24, 0,01, 3,78 bzw. 4,39 log2) beleuchtete und nicht beleuchtete Kontrollzellen (5,97, 5,21, 4,82). , − 0,19, 3,68 bzw. 4,66 log2) (Tabelle 3, Abb. 5B). Die für die Motilität kodierenden Gene wurden in Zellen unter 465-nm-LED-Beleuchtung im Vergleich zu Kontrollzellen hochreguliert (Abb. 5C). Da das Flagellum-Hauptregulatorgen flhD, sind die Gene fli und flg an der Regulation, Biosynthese und dem Zusammenbau des Flagellums beteiligt, und das Motorkomplexprotein motB wurde in E. coli O157:H7 bei Belichtung mit 465 nm hochreguliert.

Transkriptionelle Expression der Stoffwechselwege von E. coli O157:H7, behandelt unter verschiedenen Lichtwellenlängen. Als Kontrolle diente das Zellwachstum unter dunklen Bedingungen. Die KEGG-Stoffwechselwege wurden unter Verwendung des Genoms des Stamms E. coli O157:H7 generiert; Ihre transkriptionellen Expressionsniveaus werden quantitativ anhand der Liniendicke und Farbänderungen dargestellt, entsprechend ihrer Lesezahlen pro Kilobase jeder Kodierungssequenz und pro Million zugeordneter Lesewerte (RPKM).

Herunterregulierte (blau) und hochregulierte Gene (Orange) von E. coli O157:H7 unter dem Einfluss von blauem (465 nm) beleuchtetem Licht im Vergleich zur Kontrolle im Weg der oxidativen Phosphorylierung (A), Fettsäureabbau (B) und Flagellenanordnung (C). Die Pathway-Analyse der ausgewählten Gene wurde mithilfe der KEGG-Datenbank durchgeführt.

Die Exposition von E. coli O157:H7-Zellen gegenüber verschiedenen Wellenlängen von LEDs induzierte Transkriptionsänderungen, wie in der vorliegenden Studie beschrieben. Zuvor wurde die Wirkung von LEDs gegen pathogene Bakterien untersucht und festgestellt, dass blaue (461 nm) und grüne (521 nm) LEDs bei der Bekämpfung dieser Krankheitserreger wirksam sind21,22. In der vorliegenden Studie wurden drei verschiedene LED-beleuchtete Lichter verwendet, um ihre Auswirkungen auf das Bakterienwachstum zu untersuchen. Dabei wurde festgestellt, dass E. coli O157:H7-Zellen unterschiedlich auf beleuchtetes 465-nm-Licht reagieren, wie von Ghate et al.21 beschrieben. Diese Erkenntnisse könnten durch den photodynamischen Behandlungsmechanismus, der an der bakteriellen Inaktivierung beteiligt ist, näher erläutert werden. Die photodynamische Behandlung induziert die Anregung von Photosensibilisatormolekülen, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen, wenn sie Wellenlängen zwischen 400 und 500 nm absorbieren21,24. Die ROS oxidieren dann die Zellmembranbestandteile und verursachen zytotoxische Wirkungen21,25.

Basierend auf Transkriptionsunterschieden in E. coli O157:H7 beeinflusste das von verschiedenen LEDs beleuchtete Licht das Wachstumsspektrum (Abb. 1). Daher wurden die transkriptomischen Messwerte von E. coli O157:H7, die unter diesen Bedingungen gezüchtet wurden, verglichen. Eine signifikante Anzahl von DEGs wurde für E. coli O157:H7 beobachtet, die unter 465-nm-Beleuchtung gezüchtet wurden, im Vergleich zu 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung und unbeleuchteter Kontrolle (Abb. 2). Von E. coli O157:H7, Wachstumsspektrum unter unterschiedlichem LED-beleuchtetem Licht, gingen wir davon aus, dass LED-Lichter einen Einfluss auf DNA, Proteine oder Lipide haben. Basierend auf transkriptomischen Messungen von E. coli O157:H7 unter beleuchteten und unbeleuchteten Bedingungen wurden die KEGG-Stoffwechselkategorien analysiert (Abb. 3). Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in den RPKM-Werten für den Aminosäure- und Lipidstoffwechsel beobachtet (Abb. 3B). Daher reicht die Protein- und Lipidoxidation nicht aus, um unterschiedliche Wachstumsniveaus von E. coli O157:H7 zu ermitteln, die unter verschiedenen Stressbedingungen gezüchtet werden. Basierend auf der KEGG-Analyse weisen biologische, metabolische und zelluläre Prozesse die größte Anzahl von DEGs auf.

Stoffwechselprozesse von E. coli O157:H7 in der anfänglichen stationären Phase konnten anhand von KEGG-Pfaden identifiziert werden, die ein Netzwerk interagierender Moleküle aufweisen (Abb. 4). In Bakterienzellen enthalten ATP-Bindungskassetten (ABC)-Transporterproteine zwei Transmembrandomänen (TMDs) und zwei Nukleotidbindungsdomänen (NBDs)26. Die NBDs sind an der Bindung und Hydrolyse von ATP sowie an strukturellen Veränderungen in TMDs für die Öffnung von Kanälen für den Transport von Substraten beteiligt27. In E. coli-Zellen werden 5 % des gesamten Genoms durch die größte Proteinfamilie der ABC-Transporter repräsentiert, die 80 verschiedene Systeme umfasst28. In unserer Studie wurden transkriptomische Lesevorgänge, die ABC-Transportersysteme unter dem Einfluss von 465-nm-beleuchtetem Licht kodieren, im Vergleich zu anderen herunterreguliert, beispielsweise zu Genen, die am Oligopeptid-Transportsystem (oppB, oppC, oppF), dem Lipoprotein-Freisetzungs- und Transportsystem (lolA, lolB) beteiligt sind , lolC, lolD), Histidin-Transportsystem (hisP) und Lysin/Arginin/Ornithin-Transportsystem (argO). Diese extrazellulären Bindungsproteine erleichtern den Transport von Substraten in die Zelle29. Die Herunterregulierung dieser ABC-Transportergene könnte die Importfunktion der Membran zur Aufnahme von Nährstoffen für das Zellwachstum unter Einwirkung von 465 nm beleuchtetem Licht verändern und könnte der Grund für das unterdrückte Wachstum von E. coli O157:H7-Zellen im Vergleich zu gewachsenen Zellen sein unter 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung und unbeleuchteter Kontrolle.

Darüber hinaus sind eine Reihe von Enzymen an der Reduktion und Oxidation von Glucose zu Acetyl-CoA und schließlich zu Kohlendioxid unter Energiegewinnung beteiligt. Der Weg wandelt NAD+ und FAD in NADH bzw. FADH2 um, wobei ein GTP produziert wird. Anschließend produzieren NADH und FADH2 im oxidativen Phosphorylierungsweg ATPs30. In unserer auf transkriptomischen Messungen basierenden Studie wurden Gene, die am Glukosestoffwechselweg beteiligt sind, hauptsächlich Glykolyse, TCA-Zyklus, Pentosephosphat, Pentose- und Glucuronat-Umwandlungen, Fruktose und Mannose, Galaktose, Ascorbat und Aldarat sowie Gene für den Stärke- und Saccharosestoffwechsel, signifikant reduziert. reguliert in E. coli O157:H7, das unter 465-nm-Beleuchtung gezüchtet wurde, im Vergleich zu 520-nm- und 625-nm-beleuchteten und unbeleuchteten Kontrollen, die eine geringere Produktion von NADH und FADH2 und einen Energieabbau während des Kohlenhydratstoffwechsels in der exponentiellen Phase zeigten (Abb. 3) .

Allerdings produzierte der Fettsäurestoffwechsel aufgrund seiner Verfügbarkeit in einem Zustand mit hoher Reduktion und geringerer Sauerstoffanreicherung eine größere Energiemenge als andere Kohlenstoffquellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der bakteriellen Anpassung während der stationären Phase31. Gene, die mit dem Fettsäurestoffwechsel und -abbau zusammenhängen, wurden in E. coli O157:H7, das unter 465-nm-Beleuchtung gezüchtet wurde, im Vergleich zu 520-nm- und 625-nm-Beleuchtung und unbeleuchteter Kontrolle hochreguliert. Diese Gene sind an der β-Oxidationsspaltung langkettiger Fettsäuren in Acetyl-CoAs beteiligt. Zunächst aktivieren ein mit der Außenmembran assoziiertes Protein fadL und die Acyl-CoA-Synthase fadD der Innenmembran den Acyl-Mechanismus, der am Transport langkettiger Fettsäuren durch die bakterielle Zellmembran beteiligt ist, und dann wandelt fadE Acyl-CoA in Enoyl-CoA32 um. Ein tetramerer Komplex aus zwei Kopien von fadB und fadA schließt die letzten Stufen des Fettsäureabbaus ab, zu denen Hydratation, Oxidation und thiolytische Spaltung gehören. Der β-Oxidationsweg funktioniert zyklisch und verkürzt nach jedem Zyklus das zugeführte Acyl-CoA um zwei Kohlenstoffatome, um Acetyl-CoA zu produzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass E. coli O157:H7 unter dem Einfluss von 465 nm beleuchtetem Licht Fettsäuren als alternative Energiequelle zum Überleben nutzen könnte.

Unter dem Stress von 465 nm beleuchtetem Licht könnte E. coli O157:H7 außerdem ein Flagellenmotilitätssystem nutzen, um zu überleben und sich an günstige Bedingungen anzupassen. Bakterien nutzen die Flagellenmotilität als Reaktion auf Umweltreize wie pH-Wert, Temperatur, verschiedene Chemikalien, Redoxpotential und Osmolarität, die es Bakterienzellen ermöglichen, günstige Umgebungen für Wachstum und Überleben anzunehmen33. Für die Beweglichkeit verbrauchen E. coli-Zellen ausreichend zelluläres Protein und Energie für die Biogenese des Flagellen-Motilitätssystems34,35. Die Expression motilitätsbezogener Gene wirkt sich auf die Verringerung des Bakterienwachstums aus, da die Flagellenmotilität genügend Nährstoffinhalte und zelluläres Protein verbraucht, die für die Bakterienrotation erforderlich sind36,37. In unserer Studie beobachteten wir, dass die transkriptomischen Messwerte von E. coli O157:H7 unter 465-nm-Beleuchtung im Zusammenhang mit der Flagellenmotilität im Vergleich zur unbeleuchteten Kontrolle stark hochreguliert waren (Abb. 5C). Diese Hochregulierung motilitätsbezogener Gene könnte für die Verringerung des Bakterienwachstums, die Herunterregulierung der Gene für den Kohlenhydratstoffwechsel und die Hochregulierung der Gene für den Fettsäureabbau verantwortlich sein.

Darüber hinaus zeigten transkriptomische Daten auch, dass LED-Lichter auch die Quorum Sensing (QS)-Fähigkeit von E. coli O157:H7 beeinflussen. Bakterienzellen kommunizieren über QS und überwachen die Zelldichtepopulation basierend auf der Konzentration von Signalmolekülen in der Umgebung und exprimieren entsprechende Gene38,39. Das Autoinducers-2 (AI-2)-Signalmolekül ist ein speziesübergreifendes Signalsystem, das vom luxS-Gen kodiert wird und AI-2-Moleküle in 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) umwandelt38,40. Unsere Studie zeigte, dass die transkriptomischen Messwerte des LuxS unter 465-nm-Beleuchtungslicht im Vergleich zu anderen stark herunterreguliert wurden. Pathogene Stämme nutzen QS, um Virulenzfaktoren zu regulieren, und die Herunterregulierung des luxS-Gens zeigte, dass die Kommunikation zwischen Zellen unter 465-nm-Beleuchtungslicht abnehmen und damit auch das Virulenzpotenzial abnehmen könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei 465 nm beleuchtetem blauem Licht das Wachstum von E. coli O157:H7 im Vergleich zur bei 520 nm und 625 nm beleuchteten und nicht beleuchteten Kontrolle stark reduziert wurde. Die Ergebnisse der DEGs zeigten, dass einige Gene von E. coli O157:H7 unter beleuchtetem Licht mit 520 nm und 625 nm im Vergleich zu nicht beleuchteten Kontrollgruppen unterschiedlich reagieren. Die Genexpression von E. coli O157:H7 veränderte sich unter 465-nm-Beleuchtungslicht stark. Insbesondere wurden Gene im Zusammenhang mit dem Glukosestoffwechsel erheblich herunterreguliert, was zu einer Hochregulierung der Gene für den Fettsäureabbau und die oxidative Phosphorylierung während der frühen stationären Phase führte. Darüber hinaus wurden auch die motorischen Gene hochreguliert, um sich an günstige Nischen anzupassen und unter dem Stress der 465-nm-LED-Beleuchtung zu überleben. Insgesamt könnten diese Ergebnisse dazu beitragen, die Reaktion von E. coli O157:H7 unter der Wellenlänge verschiedener LEDs zu verstehen. Eine vergleichende Analyse verschiedener Wellenlängen mit der nicht beleuchteten Kontrollgruppe basierend auf transkriptomischen Messungen ergab, dass die Stoffwechselaktivitäten von E. coli O157:H7 unter beleuchteten Bedingungen signifikant beeinflusst wurden.

E. coli O157:H7 (C7927; Apfelwein-Isolat), erhalten von Dr. Kun-Ho Seo an der Konkuk-Universität, Republik Korea, wurde in dieser Studie als Modellstamm verwendet, da er aus frischen Produkten isoliert wurde. Eine gefrorene Kultur von E. coli O157:H7 wurde durch 24-stündige Inkubation bei 37 °C in 10 ml steriler Trypton-Sojabrühe (TSB; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) aktiviert. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 4 ° C und 3500 × g zentrifugiert und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Biosesang, Seongnam-si, Korea) gewaschen. Die Zellen im resultierenden Pellet wurden in 1 ml PBS resuspendiert und unter Verwendung von PBS seriell auf etwa 104 KBE/ml verdünnt. Die letzte Reihenverdünnung von 104 KBE/ml wurde in 10 ml sterilem TSB für die LED-Beleuchtung hergestellt.

Hochintensive LEDs (10 W) mit Wellenlängen von 465, 520 und 625 nm wurden von Shenzhen Getian Opto-Electronics Co., Ltd. (Shenzhen, Guangdong, China) gekauft. Die Spezifikationen jeder LED sind in Tabelle 1 beschrieben. LEDs (8 x 8 mm) wurden an einem Kühlkörper und einem Lüfter befestigt, um die Wärmeübertragung auf die Zellsuspension zu reduzieren. Jedes LED-System war mit einem Gehäuse aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) umgeben, um das Eindringen von externem Licht während der LED-Beleuchtung zu verhindern, wie in Abb. 6 dargestellt. Für die LED-Beleuchtung wurden 10 ml Zellsuspension in TSB in ein steriles Petri überführt Schale (57 mm Durchmesser) mit 8 mm Tiefe und direkt unter den LED-Lampen in einem Abstand von 80–150 mm platziert, um eine photosynthetische Photonenflussdichte (PPFD) von 300 μmol/m2s einzustellen, was die optimale Voraussetzung für die LED-Beleuchtung von Salat darstellt in der Pflanzenfabrik21,41. Der PPFD jeder LED im System wurde mit einem PPFD-Messgerät (PAR-100, J&C Technology, Gimcheon-si, Korea) im gleichen Abstand gemessen. Die Temperatur von TSB in jedem LED-System wurde mit einem Thermoelementthermometer Fluke 5.4 (Everett, WA, USA) während der LED-Beleuchtung 4 Stunden lang überwacht.

Versuchsaufbau zur Überprüfung des Wachstums von E. coli O157:H7 unter dem Einfluss von Licht unterschiedlicher Wellenlänge.

Zehn Milliliter Zellsuspension in TSB wurden 24–30 Stunden lang mit einer 465-, 520- und 625-nm-LED bei der eingestellten Temperatur von 24,5 °C beleuchtet. Das Zellwachstum unter LED-Beleuchtung wurde regelmäßig durch Probenentnahme in geeigneten Zeitintervallen, Verdünnung in 0,1 % (Gew./Vol.) Peptonwasser (PW; Oxoid) und Ausplattieren auf tryptischem Sojaagar (TSA; Oxoid) überwacht. Die unter dunklen Bedingungen (nicht beleuchtet) bei der eingestellten Temperatur von 25 °C gezüchteten Zellen dienten in dieser Studie als Kontrolle. Die Anzahl lebensfähiger Zellen, ausgedrückt als log KBE/ml, wurde gegen die Zeit aufgetragen. Die Wachstumskurven wurden erstellt, indem die Daten mithilfe von DMFit (https://browser.combase.cc/DMFit.aspx) und den Wachstumsparametern, nämlich Lag-Phase-Dauer (LPD), an die Gleichung von Baranyi und Roberts (1994) angepasst wurden. spezifische Wachstumsrate (GR), Verdopplungszeit (DT) und maximale Populationsdichte (MPD) wurden berechnet. Basierend auf der Wachstumskurve wurde auch die Zeit für die frühe stationäre Phase der Zellen unter jeder LED-Beleuchtung bestimmt und die Zellen wurden auf Toleranz gegenüber jeder Stressbedingung und RNA-Seq-Analyse untersucht.

Die transkriptomische Analyse wurde dreifach an LED-beleuchteten und unbeleuchteten Kontrollzellen durchgeführt, um die Unterschiede in der Transkriptionsreaktion von E. coli O157:H7 zwischen 465-, 520- und 625-nm-LEDs und unbeleuchteten Kontrollzellen besser zu verstehen. Unbeleuchtete und beleuchtete E. coli O157:H7-Zellen für die frühe stationäre Phase wurden mit einem RNA-Protect-Bakterienreagenz (Qiagen, Hilden, Deutschland) stabilisiert und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines RNeasy Mini-Kits (Qiagen) mit einem gDNA-Eliminator-Spin isoliert Säule (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Konzentration und Reinheit der extrahierten RNA wurden mit einem NanoVue Plus-Spektrophotometer (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) bestimmt und die Integrität durch Agarosegelelektrophorese bestätigt.

Für den Bibliotheksaufbau und die Sequenzierung wurden Proben der Gesamt-RNA in dreifacher Ausfertigung bei Macrogen Inc. (Seoul, Republik Korea) durchgeführt. Kurz gesagt, die rRNA in der Gesamt-RNA wurde mit einem Epicenter Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria) (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) abgereichert und anschließend wurden Sequenzierungsbibliotheken mit einem TruSeq Stranded Total RNA Sample Prep Kit (Illumina Inc.) erstellt .) gemäß den Herstellerangaben. Genomdaten wurden auf einem HiSeq 4000-System (Illumina Inc.) unter Verwendung eines Paired-End-Protokolls und einer Leselänge von 2 × 100 bp generiert. Die Qualität der Rohsequenzen wurde mit der FastQC-Software (Version 0.11.7; Babraham Bioinformatics, Cambridge, UK) überprüft. Vor der Analyse wurden die rohen Paired-End-Reads mit einem Trimmomatic-Programm42 (Version 0.38) getrimmt und qualitätsgefiltert und durch Entfernen von Adaptersequenzen und Basen geringer Qualität (Basisqualitätslänge <3 und Schiebefenstergröße 4 und Qualitätsbewertung 15) generiert. und kurze Lesevorgänge (< 36 bp). Nach der Qualitätskontrolle wurden die getrimmten Lesevorgänge mithilfe eines Bowtie-Programms (Version 1.1.2; http://bowtie-bio.sourceforge) auf das Referenzgenom von E. coli O157:H7 (GenBank: GCF_000008865.2, NCBI: asm886v2) abgebildet. net/index.shtml). Die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge für jedes Gen wurde mit einem HTseq-Programm (Version 0.10.0; http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview.html) gezählt, um die Expression zu messen. Der Differentially Expression Genes (DEGs)-Assay wurde mit der Methode „Reads per Kilobase Transcript per Million Mapped Reads“ (RPKM) analysiert. Die statistische Analyse wurde mit dem Fold Change (FC), dem unabhängigen T-Test und der hierarchischen Clusterbildung durchgeführt. Es wurden die Bedingungen |FC|≥ 2 und unabhängiger T-Test-Roh-P-Wert < 0,05 ausgewählt. Eine hierarchische Clusteranalyse wurde mit euklidischen Abständen und vollständiger Abstammung als Maß für die Ähnlichkeit jedes Gens in jeder Probe durchgeführt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde nach der von Curiel et al.43 beschriebenen Methode durchgeführt.

Funktionelle Gene des LED-beleuchteten E. coli O157:H7 wurden mithilfe von Prokka mit Standardparametern44 aus Genomen identifiziert und mit BlastKOALA (http://www.kegg.jp/blastkoala/)45 funktionell annotiert. In jeder KEGG-Kategorie wird die Transkriptionsexpression der Gene als Summe der Lesezahlen pro Kilobase jeder kodierenden Sequenz pro Million kartierter Lesevorgänge (RPKM) von mRNA-Lesevorgängen angezeigt, die jeder KEGG-Funktionskategorie zugeordnet sind. Darüber hinaus wurden auf der Grundlage der KEGG-Orthologie (KO)-Zahlen der funktionellen Gene Stoffwechselwege der LED-beleuchteten Zellen und der nicht-beleuchteten Kontrollzellen von E. coli O157:H7 im iPath v3-Modul (https://pathways.com) generiert .embl.de/)46. Die Transkriptionsniveaus der KEGG-Wege von E. coli O157:H7 unter LED-Beleuchtung und Nicht-Beleuchtung wurden relativ unter Verwendung unterschiedlicher Liniendicken und Farbhelligkeiten basierend auf der Summe der RPKM-Werte aller funktionellen Gene dargestellt.

Alle Experimente wurden dreifach wiederholt und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für die statistische Analyse wurde SPSS Version 25 (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, USA) verwendet. Die Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Duncans Post-hoc-Mehrbereichstest überprüft. Die Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter den Zugangsnummern SRX18394425 bis SRX18394436 (NCBI BioProject-Zugangsnummer PRJNA905884) öffentlich verfügbar.

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Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Bildungsministerium (Nr. 2017R1D1A1B04031128) und (Nr. 2021R1A6A1A03046418).

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Min-Jeong Kim

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und -technologie, Korea National University of Transportation, 61 Daehark-Ro, Jeungpyeong-Gun, Chungbuk, 27909, Republik Korea

Hyun Gyun Komm schon

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Konzeptualisierung, HGY und MJK; Methodik, HGY und SAK; Software, MJK, SAK; Validierung, SAK, HGY; formale Analyse, SAK, HGY; Untersuchung, SAK; Ressourcen, HGY, MJK; Datenkuration, HGY, MJK und SAK; Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung, SAKHGY und MJK; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, HGY und MJK; Visualisierung, SAKHGY und MJK; Supervision, HGY und MJK; Projektverwaltung, HGY; Finanzierungseinwerbung, HGY Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Hyun-Gyun Yuk.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Khan, SA, Kim, MJ. & Yuk, HG. Genomweite Transkriptionsantwort von Escherichia coli O157:H7 auf Leuchtdioden mit verschiedenen Wellenlängen. Sci Rep 13, 1976 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28458-7

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Eingegangen: 17. November 2022

Angenommen: 18. Januar 2023

Veröffentlicht: 3. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28458-7

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