Vergleichende Genomik zeigt einen einzigartigen Stickstoff

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4334 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Asteraceae (Gänseblümchengewächse) sind eine der größten Pflanzenfamilien. Die genetische Grundlage für seine hohe Artenvielfalt und hervorragende Anpassungsfähigkeit ist nicht geklärt. Hier vergleichen wir die Genome von 29 Landpflanzenarten, darunter zwei De-novo-Genomanordnungen im Chromosomenmaßstab für Stängelsalat, ein Mitglied der Asteraceae, und Scaevola taccada, ein Mitglied der Goodeniaceae, die eine der engsten Außengruppen der Asteraceae darstellt. Wir zeigen, dass Asteraceae vor etwa 80 Millionen Jahren entstanden sind und eine wiederholte Paläopolyploidisierung erlebt haben. PII, der universelle Regulator der Stickstoff-Kohlenstoff (NC)-Assimilation, der in fast allen Lebensbereichen vorkommt, hat bei Asteraceae deutlich verloren. Inzwischen hat Asteraceae das NC-Gleichgewichtssystem durch Paläopolyploidisierung und Tandem-Duplikationen wichtiger Stoffwechselgene schrittweise verbessert, was zu einer verbesserten Stickstoffaufnahme und Fettsäurebiosynthese führte. Das für Asteraceae beschriebene einzigartige NC-Gleichgewichtssystem legt nicht nur eine molekulare Grundlage für ihren ökologischen Erfolg nahe, sondern bietet auch eine potenzielle Strategie zur Verbesserung der Nutzpflanzen.

Angiospermen (Blütenpflanzen) erlebten eine schnelle terrestrische Strahlung und Artenvielfalt und erlangten schließlich vor dem Ende der Kreidezeit eine ökologische Dominanz, die Charles Darwin bekanntermaßen als „ein abscheuliches Mysterium“1 bezeichnete. Insbesondere die Korbblütler (Asteraceae) konkurrieren mit den Orchidaceae um die größte Familie der Blütenpflanzen. Die Asteraceae umfassen mehr als 1620 Gattungen und 30.000 Arten und machen etwa 10 % aller blühenden Arten aus (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Anmerkung 1)2,3. Der Artenreichtum der Asteraceae ist viel größer als der verwandter Familien in der Ordnung Asterales, einschließlich Calyceraceae (47 Arten), Goodeniaceae (430 Arten) und Menyanthaceae (60 Arten)3. Als ökologisch erfolgreichste Familie mit unglaublicher Vielfalt und ausgezeichneter Anpassungsfähigkeit kommen ihre Mitglieder in nahezu allen Arten von Lebensräumen auf der Erde vor, einschließlich extremer Umgebungen wie Wüsten und Salzebenen (Ergänzende Abbildung 1)4. Ein weiteres Beispiel, das die außergewöhnliche Anpassungsfähigkeit der Asteraceae verdeutlichen kann, ist die Tatsache, dass die Pflanzen dieser Familie zu den ersten drei auf der Liste der weltweit invasiven Arten gehören (ergänzende Abbildung 1). Es wird angenommen, dass der ökologische Erfolg der Asteraceae mit ihrer spezifischen Morphologie und Physiologie zusammenhängt. Beispielsweise trägt der charakteristische Blütenstand (Capitulum) wesentlich zur ökologischen Strahlung bei, indem er Insektenbestäuber anlockt, die in hohem Maße auf die Ernährung und Fortpflanzung dieser Familie angewiesen sind5. Die achänenähnlichen Früchte (Cypselae) mit Borstenpappus fördern die Verbreitung durch den Wind oder heften sich an das Fell oder Gefieder von Tieren2. Beide Verteilungsmethoden führen dazu, dass die Samen über eine größere Distanz verteilt werden als bei den meisten anderen Samenarten. Darüber hinaus sind Fruktane vom Inulin-Typ anstelle von Stärke die primären Reservekohlenhydrate in den Asteraceae und haben potenzielle Funktionen, um ihre Fähigkeit zur Anpassung an Umweltherausforderungen zu verbessern6,7,8. Allerdings bleibt es für Biologen immer noch eine große Herausforderung, die explosive Diversifizierung und Anpassungsfähigkeit der Asteraceae schrittweise zu verstehen.

Der Ursprung und die frühe Entwicklung der Asteraceae sind unklar und rätselhaft. Die jüngsten phylogenetischen Studien der Asteraceae anhand neuer fossiler Beweise und einer breiteren Stichprobe der Familie legten ihren Ursprung irgendwann in der späten Kreidezeit (vor 69–89 Millionen Jahren [MYA]) fest2,5,9. Aufgrund der vorhandenen Fossilienbestände galt die Familie bis vor Kurzem als relativ jung (40–50 MYA), und dieser Zeitrahmen stimmt mit dem überein, der von molekularen Uhren bereitgestellt wird2,10,11. Ein Paläopolyploidisierungsereignis wurde vorgeschlagen und von Unterfamilien in der Nähe des Kronenknotens von Asteraceae geteilt, was in jüngsten Genomanalysen als eine Verdreifachung des gesamten Genoms angesehen wurde10,12,13,14. Darüber hinaus wurde geschätzt und vorhergesagt, dass häufige potenzielle antike Duplikationen des gesamten Genoms (WGDs) bei mehreren Stämmen eine Kraft sind, die die Evolution vorantreibt und die Biodiversität erhöht, wenn man bedenkt, dass Polyploidisierungen alle Gene gleichzeitig duplizieren und reichlich genetisches Material für evolutionäre Prozesse wie Neofunktionalisierung bereitstellen. Subfunktionalisierung und Generhaltung aufgrund von Dosierungseffekten13,15. Einblicke in die Polyploidisierung ermöglichen es, die genetische Basis spezifischer Merkmale von Asteraceae durch die Untersuchung hochwertiger Genome mithilfe modernster Sequenzierungstechnologien zu ermitteln.

Stickstoff (N) ist zusammen mit Kohlenstoff (C) ein Hauptbestandteil der lebenswichtigen Nukleotide und Proteine, seine Verfügbarkeit ist jedoch oft ein limitierender Faktor für das Pflanzenwachstum in natürlichen Ökosystemen. Der zelluläre N- und C-Metabolismus in Pflanzen wird durch Sensor- oder Regulierungsgene fein koordiniert, um ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung aufrechtzuerhalten16. Beispielsweise fungieren die PII-Proteine ​​als Reporter des C-Stoffwechselzustands der Zelle, indem sie ATP/ADP und 2-Oxoglutarat (2-OG) interdependent binden17. Darüber hinaus werden die zellulären Glutaminspiegel in Pflanzen zusätzlich über PII-Signale erfasst16,17,18. Die Funktionsweise von PII bleibt in den drei Lebensbereichen unter der Kontrolle von PII-Zielprotein-Wechselwirkungen über die Bindung von Effektormolekülen erhalten. Ökologisch erfolgreiche Taxa entwickeln erfolgreiche und effiziente N-Assimilationssysteme, um in rauen Lebensräumen zu überleben oder um Nahrung zu konkurrieren. Ungefähr 90 % der Arten innerhalb der Familie der Leguminosae können atmosphärischen N durch eine symbiotische Verbindung mit Bodenbakterien binden und haben sich durch die spektakulärsten Strahlungen verbreitet19. Orchideen gehören zu den ganz wenigen Blütenpflanzenlinien, denen es gelungen ist, epiphytische oder lithophytische Nischen erfolgreich zu besiedeln, indem sie sich an Bäumen oder Felsen festklammern und unter trockenen Bedingungen mithilfe des Säurestoffwechsels von Crassulacea wachsen20. Wir vermuten begründet, dass es ungewöhnliche Faktoren im Nährstoffabsorptionssystem von Asteraceae geben könnte.

In dieser Arbeit generieren wir zwei hochwertige Genomassemblierungen von Stängelsalat (Lactuca sativa var. angustana), einer repräsentativen Nutzpflanze der Asteraceae, und Scaevola taccada, einer repräsentativen Pflanze der Familie Goodeniaceae, der Schwesterlinie von Calyceraceae und Asteraceae (Abb. 1a, b). Es wird eine vergleichende genomische Analyse aller 29 Taxa durchgeführt, darunter sieben Asteraceae-Arten und 22 Arten, die Vertreter verschiedener evolutionärer Klassen von Landpflanzen sind. Es deckt die Geschichte der genomischen Evolution, der genomischen Architektur und der genfunktionellen Differenzierung von Asteraceae auf, die möglicherweise zu ihrer Einzigartigkeit und Vielfalt führen könnte. Bemerkenswert ist, dass das konservierte regulatorische Gen, das das Gleichgewicht der N/C-Assimilation aufrechterhält, PII, in der Familie der Asteraceae während ihres genomischen Übergangs verloren geht. Es wurde ein einzigartiges NC-Gleichgewichtssystem vorgeschlagen, das die Absorption von N und die Fettsäuresynthese abdeckt, aber nicht darauf beschränkt ist und eine solide molekulare Grundlage für die Anpassungsfähigkeit von Asteraceae bietet.

a Phylogene Beziehung zwischen Stängelsalat und Sc. Taccada. Rote Pfeile zeigen ihre jeweiligen Familien an, Asteraceae und Goodeniaceae. Der Baum wurde von Angiosperm Phylogeny (http://www.mobot.org/MOBOT/research/-APweb/) übernommen. b Lebensraum, Morphologie und Blüten von Stängelsalat und Sc. Taccada. Typischer Lebensraum von Sc. Taccada an einem tropischen Strand in Sanya, Provinz Hainan, China (oben links); Blumen von Sc. Taccada (oben rechts); Morphologie von Stängelsalat als Handelsware im Supermarkt (unten rechts); Blüten von Stängelsalat (unten links). c Genommerkmale von Stängelsalat und Sc. Taccada. Die Spuren vom äußeren zum inneren Kreis zeigen I, Chromosomen-Karyotypen; II, Gendichte in 1-MB-Fenstern; III, Genexpressionsniveaus (gemittelte FPKM in 1-MB-Fenstern); IV, Dichte von LTR-RTs (1-MB-Fenster); V, DNA-Transposondichte (1-Mb-Fenster); VI, GC-Gehalt; VII, Syntenie zwischen den beiden Genomen.

Die De-novo-Genomassemblierung für Stängelsalat basierte auf einem Satz von Einzelnukleotid-Echtzeitsequenzierung (SMRT) mit 105-facher Abdeckung, optischer Kartierung mit 119-facher Abdeckung und Chromosomenkonformationserfassung mit 108-facher Abdeckung (Hi-C ) Sequenzierung und Illumina-Lesevorgänge mit 158-facher Abdeckung (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzende Anmerkungen 2 und 3). Die N50-Größen der Contigs, Gerüste mit optischer Kartierung und Gerüste, die weiter mit Hi-C analysiert wurden, betrugen 4,95 MB, 186,5 MB bzw. 332,3 MB (Ergänzungstabellen 2 und 3). Das endgültig zusammengesetzte Genom, nämlich SL1.0, ist 2589,7 MB groß und umfasst neun Pseudochromosomen und die vollständigen Genome von Chloroplasten und Mitochondrien (Abb. 1c, Ergänzungstabellen 2 und 3, Ergänzende Anmerkung 4 und Ergänzende Abbildungen 2–5). .

Die in dieser Studie erstellten RNA-Seq-Datensätze aus verschiedenen Geweben und alle exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) von Salat aus NCBI wurden zur Vorhersage der Gene und zur Kommentierung des Genoms verwendet (Ergänzende Anmerkung 5 und ergänzende Abbildung 6). Insgesamt wurden 40.341 Protein-kodierende Gene mit hoher Zuverlässigkeit und 5453 nicht-kodierende RNAs identifiziert und ihre Funktionen durch Suche in sechs öffentlich zugänglichen Datenbanken kommentiert (Ergänzungstabellen 4 und 5). Schließlich wurden zusammen mit der Annotation anhand der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) mehr als 85 % der Gene annotiert (Ergänzungstabelle 4).

Zur Beurteilung der Genomqualität wurden verschiedene Mittel eingesetzt (Ergänzende Anmerkung 6 und Ergänzende Abbildungen 7–9). Zunächst wurde ein paarweiser Abgleich zwischen SL1.0 und dem Genom einer anderen Salatsorte (La. sativa var. capitata) durchgeführt, und zusätzlich zu seiner starken Kollinearität und Konsistenz war SL1.0 viel vollständiger (ergänzende Abbildung 8). . Zweitens konnten 98,37 % aller Illumina-Lesevorgänge bzw. 95,32 % der ESTs ordnungsgemäß auf die SL1.0-Baugruppe (Ergänzungstabellen 6–8) und ihre Basisgenauigkeit, die als Qualitätswert (QV) bezeichnet wird, neu ausgerichtet werden. wurde auf mindestens 42,38 geschätzt, was besser war als die beiden günstigen veröffentlichten Säugetiergenome (QV35 für Gorillas und QV34,5 für Ziegen)21,22. Drittens deckte das Genom 95,9 % der gesamten Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO) ab und ~92,3 % davon wurden in mindestens einem Gewebe exprimiert (Ergänzungstabelle 9 und Ergänzungsabbildung 7). Ein bemerkenswertes Merkmal von SL1.0 ist der hohe Anteil sich wiederholender Elemente, der mehr als 87 % ausmachte (Ergänzungstabelle 10). Nach einer sorgfältigen Untersuchung der langen terminalen Wiederholungen (LTRs) liegt der LTR-Assembly-Index (LAI) von SL1.0 bei 18,13, vergleichbar mit der Qualität von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana, Reis und Mais (ergänzende Abbildung). . 9)23. Darüber hinaus erfasste SL1.0 fünf lange Abschnitte von Telomersequenzen an beiden Enden der fünf Chromosomen mit Wiederholungszahlen im Bereich von 294 bis 1073 (Ergänzungstabelle 11). Die zuvor beschriebene Kombination bewies, dass das Genom von Stängelsalat ein qualitativ hochwertiges Genom in Asteraceae ist.

Ebenso ist die De-novo-Genomassemblierung für Sc. Taccada basierte auf einem Satz von SMRT-Lesevorgängen mit 102-facher Abdeckung, Hi-C-Lesevorgängen mit 102-facher Abdeckung und Illumina-Lesevorgängen mit 105-facher Abdeckung (Ergänzungstabelle 12, Ergänzende Anmerkungen 7 und 8 sowie ergänzende Abbildungen 10–13). ). Es ist uns gelungen, die Baugruppe von Sc zu generieren. Taccada, nämlich ST1.0, mit einer Größe von 1159 MB, einschließlich acht Gerüsten im Chromosomenmaßstab, bei denen Contig N50 bis zu 9, 6 MB betrug, und mit vollständigen Genomen der Chloroplasten und Mitochondrien (Abb. 1c, Ergänzungstabellen 13 und 14, Ergänzende Anmerkung 9 und ergänzende Abbildungen 11–13). Die Wiederholungssequenzen umfassten ~952 Mbit/s (über 80 % der Anordnung) und die LTR-Retrotransposons (LTR-RTs) besetzten fast 82 % aller Wiederholungen (Ergänzungstabelle 15 und Ergänzende Anmerkung 10). Als die RNA-Seq-Datensätze aus vier verschiedenen Geweben zur Annotation von ST1.0 verwendet wurden, wurden 25.328 proteinkodierende Gene und 4219 nicht-kodierende RNAs mit detaillierten Annotationsinformationen erhalten (Ergänzungstabellen 16 und 17 und Ergänzende Anmerkung 10). Darüber hinaus waren die Wiederholungssequenzen des Genoms mit einem LAI von bis zu 12,01 gut zusammengesetzt. Die von BUSCO geschätzte Vollständigkeit von ST1.0 erreichte 94,2 % (Ergänzungstabelle 18 und Ergänzungsabbildung 14). Alle anderen Bewertungen, die mit den gleichen Methoden wie SL1.0 ermittelt wurden, weisen auf eine hohe Qualität und Vollständigkeit von ST1.0 hin (Ergänzungstabellen 18 und 19).

Um den Ursprung und die Genomentwicklung von Asteraceae zu untersuchen, verwendeten wir die Genome von Sc. Taccada und 21 Vertreter verschiedener phylogenetischer Zweige von Landpflanzen und aller sieben sequenzierten Asteraceae, einschließlich Salat (Abb. 2a, ergänzende Abbildungen 15 und 16 und ergänzende Anmerkung 11). Wir haben die Abstammungsdifferenzierungszeit von Sc verfolgt. Taccada und Asteraceae bis vor etwa 78–82 Millionen Jahren (MYA) in der späten Kreidezeit (Abb. 2a), was mit Erkenntnissen aus der jüngsten Kuratierung von Pollenkorn-Fossilienbeständen und molekularen Analysen auf der Grundlage verstreuter Genom- und Transkriptomsequenzen übereinstimmt2,5 .

a Phylogenie und Zeitskala von 29 repräsentativen Landpflanzenarten. Graue Balken an Knoten stellen 95 %-Konfidenzintervalle der geschätzten Divergenzdaten dar, während roter Pfeil und Stern den Ursprung der Asteraceae vor etwa 80 Millionen Jahren (MYA) in der späten Kreidezeit anzeigen. Die Zahlen an jedem Zweig oder Knoten stellen Erweiterungen (rot) und Kontraktionen (schwarz) orthologer Gruppen dar. MRCA: jüngster gemeinsamer Vorfahre. b Dichteverteilung der geschätzten synonymen Substitutionsrate (Ks) von Syntelog-Paaren für intragenomische Vergleiche (Sc. taccada, Salat (La. sativa), Sonnenblume (Helianthus annuus), Artischocke (Cynara cardunculus) und Kaffee (C. arabica)) und für Sc. Taccada versus Kaffee, Salat und Artischocke. c Makrosyntenie-Visualisierung der Genome von Weinrebe (Vitis vinifera), Kaffee, Sc. Taccada, Salat und Artischocke, die Verdreifachungsereignisse bei Asteraceae zeigen. Drei Beispiele für Syntelogs sind in Rot, Grün und Blau gefärbt, wobei eine Kopie in den Farben Grapevine, Coffee und Sc vorliegt. Taccada, und drei Exemplare sind in Salat und Artischocke. Zahlen geben Chromosomen an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben die Anzahl der synonymen Substitutionen pro synonymer Site (Ks) aller Paralogs berechnet. Die Ks-Verteilung ergab unterschiedliche Polyploidisierungsereignisse, die bei den Asteraceae-Arten auftreten, einschließlich der angestammten Verdreifachung des Gesamtgenoms der Eudicots (WGT-γ)24, der Verdreifachung des Gesamtgenoms, die bei den Asteraceae-Arten (WGT-1)12,14 gemeinsam ist, und eine linienspezifische Duplikation des gesamten Genoms im Sonnenblumengenom (WGD-2)10 (Abb. 2b und Ergänzende Anmerkung 12). Sc. Taccada hatte mit Kaffee (Coffea arabica) einen deutlichen Ks-Höhepunkt, was darauf hindeutet, dass Sc. Taccada und Kaffee erlebten nur das WGT-γ-Ereignis, ein altes WGT-Ereignis, das etwa 122–164 MYA auftrat10,24, was mit früheren Ergebnissen des Scaevola aemula-Transkriptoms übereinstimmte25. Die ähnlichen Ks-Verteilungsprofile von Paralogs zwischen Sc. Taccada im Vergleich zu Salat und Salat im Vergleich zu Salat zeigten, dass das WGT-Ereignis kurz nach der Cladogenese zwischen Asteraceae und Goodeniaceae auftrat (Abb. 2b und ergänzende Abb. 17a). WGT-1 war das einzige WGT-Ereignis, das nach WGT-γ bei den Asteraceae-Vorfahren auftrat. Der intergenomische Vergleich und die Syntenieanalysen stützten diese Beobachtung ebenfalls (Abb. 2c und Ergänzende Anmerkung 12). Darüber hinaus legen diese Analysen nahe, dass das WGT-1-Ereignis ungefähr zum Zeitpunkt der Bildung von Asteraceae stattfand (Abb. 2a).

Wir untersuchten auch die dreifach erhaltenen Regionen (TRRs) nach dem WGT-1-Ereignis mithilfe des Sc. Taccada-Genom als Referenz (Ergänzungstabelle 20, Ergänzende Anmerkung 13 und Ergänzende Abbildung 18). Wir haben in den TRRs wichtige homologe Gene entdeckt, die für wesentliche biologische Prozesse (z. B. Blüte, Zellwandbiosynthese/-stoffwechsel, Fettsäurebiosynthese) verantwortlich sind. Eine weitere Analyse TRR-angereicherter Gene ergab, dass Gene, die mit der Zellwand, der Proteinphosphorylierung, der Fettsäurebiosynthese und der Zellmembran zusammenhängen, selektiv erhalten blieben (Ergänzende Abbildung 17b, Ergänzende Daten 1–5 und Ergänzende Anmerkung 13). Alle diese Funktionen stehen in engem Zusammenhang mit Stressreaktionen und der Anpassung an die Umwelt. Beispielsweise können Pektinmethylesterasen (PMEs) die Zellwandmodifikation erleichtern. Gene, die für Delta-9-Acyl-Lipid-Desaturasen (ADSs) und MIKC-MADS-Transkriptionsfaktoren kodieren, zeigten ein ähnliches Retentionsmuster (Ergänzende Abbildungen 17c, 19 und 20 und Ergänzende Anmerkung 13). Die unterschiedliche genomische Zusammensetzung von TRRs mit deutlich höheren Genregionen und geringeren repetitiven Sequenzen im Vergleich zu denen des gesamten Genoms weist darauf hin, dass diese Regionen bevorzugt ausgewählt wurden (Ergänzende Abbildung 17d und Ergänzende Anmerkung 13). Eine Anreicherungs- und Verarmungsanalyse der Wiederholungselementfamilien in diesen TRRs zeigte, dass die Abnahme der Wiederholungselemente hauptsächlich durch die Deletion von LTR-RTs verursacht wurde (Ergänzende Abbildung 21 und Ergänzende Anmerkung 14), die die Asteraceae-Genome erheblich erweitert und dominiert haben (Ergänzende Anmerkung 14, Ergänzende Daten 6–10, Ergänzende Tabelle 21 und Ergänzende Abbildungen 22–35).

Als nächstes analysierten wir die Entwicklung der Genfamilie basierend auf dem phylogenetischen Baum und orthologen Gruppen im Asteraceae-Knoten und im Asteraceae- und Goodeniaceae-Familienknoten (Abb. 2a, Ergänzende Anmerkung 15 und Ergänzende Abb. 36). Die sich schnell entwickelnden Genfamilien waren an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt, insbesondere an der Fortpflanzung, der Reaktion auf Reize, der Immunität und den Nährstoffspeichern (ergänzende Abbildung 37). Parallel dazu analysierten wir die funktionellen Domänen dieser Gene und identifizierten 107 Interpro-Einträge, die mit mindestens zwei Asteraceae-Arten angereichert waren (P <0, 05) (Supplementary Data 11 und Supplementary Note 16). Bemerkenswerterweise standen 18 Einträge im Zusammenhang mit (Retro-)Transposon-Domänen und mehreren Arten von Zinkfinger-Domänen, einschließlich Zinkfinger-CCHC-Typ, BED-Typ, PMZ-Typ, TTF-Typ, SWIM-Typ und GRF-Typ identifiziert (Supplementary Data 11). Eine weitere angereicherte Gruppe bezog sich auf die Fettsäurebiosynthese, wie Acyl-CoA-Desaturasen, Beta-Ketoacyl-Synthasen und Fettsäure-Desaturasen (FADs) (Supplementary Data 11). Wir haben außerdem 114 orthologe Gengruppen in vier Kategorien als linienspezifisch in Asteraceae identifiziert, darunter Transkriptionsfaktor-Gene wie bHLH, MYB, Znf, SPL und MADS-Box, eine Unterklasse der FERONIA-Rezeptorkinase-Familie, Gene für den wichtigen Sekundärstoffwechsel in Asteraceae (z. B. Inulin- und Alkaloidbiosynthese) und Zellumbau (Ergänzende Anmerkung 17, Ergänzende Tabellen 22 und 23, Ergänzende Daten 12 und 13 und Ergänzende Abbildungen 38–48).

Wir untersuchten auch Gene, die in den sieben sequenzierten Asteraceae-Arten fehlten (Ergänzungstabelle 24 und Ergänzende Anmerkung 18). Das auffälligste Fehlen bei allen sieben Asteraceae und Sc. Taccada war PII. PII kommt in allen drei Lebensbereichen weit verbreitet vor und spielt eine zentrale Rolle bei der Wahrnehmung und Regulierung von NC-Signalen18. Wir verwendeten die Transkriptomdaten der One Thousand Plant Transcriptomes (1KP) Initiative26, darunter 39 Asteraceae-Arten und Fächerblumen (Scaevola mossambicensis), eine weitere Goodeniaceae-Art, und bestätigten den Verlust von PII bei den Asteraceae und Goodeniaceae (Abb. 3a, Ergänzende Anmerkung). 19, Ergänzende Daten 14 und Ergänzende Tabelle 25), was darauf hinweist, dass PII beim Vorfahren von Asteraceae und Goodeniaceae verloren ging.

eine phylogenetische Verteilung von PII in 1090 Grünpflanzen aus der Sammlung der One Thousand Plant Transcriptomes Initiative (OTPTI). Links wird ein vereinfachter phylogenetischer Baum angezeigt und rechts werden Arten oder andere taxonomische Namen aufgelistet. Klassen ohne PII sind in roter Schrift gekennzeichnet. b Kolinearitätsanalyse der PII-haltigen Region in Karotte (D. carota), Sc. Taccada und Salat. PII-haltiges Chromosom 1 in Karotte und die entsprechenden zusammengesetzten Chromosomen in Sc. Taccada und Salat werden vertikal dargestellt. Rote und schwarze Linien auf den Chromosomen weisen auf die Existenz bzw. den Verlust von PII hin. Der Grauton und das Genom-Syntelog im Einschub zeigen die chromosomale Neuordnung zwischen Karotte und Sc. Taccada. c, d Mikrosyntenie-Visualisierung der kolinearen Chromosomenregionen zwischen Karotte und Sc. Taccada (c) und zwischen Karotte und Salat (d). Die Position von PII in Karotten ist mit roten Pfeilen markiert. e Bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsanalyse (BiFC), die die Wechselwirkung zwischen LsNAGK und PII (DcPII) in vivo zeigt. f GST-Pulldown-Assays, die die Wechselwirkung zwischen LsNAGK und PII (DcPII) in vitro zeigen. Jedes Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um nachzuverfolgen, wie PII verloren ging, wählten wir eine andere Art außerhalb der Gruppe, die Karotte (Daucus carota), als Referenz und führten paarweise syntenische Analysen mit Sc durch. Taccada und andere Asteraceae-Arten (Abb. 3b und Ergänzende Anmerkung 19). Im Gegensatz zur Karotte, bei der der PII-haltige syntenische Block in der Mitte des Unterarms von Chromosom 1 abgebildet ist, befand sich dieser syntenische Block entlang der Telomerregionen in den Genomen von Asteraceae und Goodeniaceae (Abb. 3b). Die paarweise Syntenie deutete auf eine umfangreiche chromosomale Umlagerung zwischen Karotte (Chr 01) und Sc hin. Taccada (Chr 05) und PII befanden sich am Rand des neu angeordneten Bereichs (Abb. 3b). Darüber hinaus haben wir eine Mikroinversion (mit 20–30 Genen) zwischen Karotte und Sc festgestellt. Taccada (Abb. 3c) und zwischen Karotte und Salat (Abb. 3d). PII befand sich am Rand des invertierten Bereichs (Abb. 3c, d). Wenn wir diese Ergebnisse zusammenfassen, schlagen wir vor, dass es bei den Vorfahren von Goodeniaceae und Asteraceae zu einer Chromosomenumlagerung mit anschließender Mikroinversion kam, die zum Verlust von PII führte.

PII ist ein im Chloroplasten lokalisierter N-Sensor, der den N-Acetyl-L-Glutamat-Kinase-Komplex (NAGK) aktiviert, um die N-Assimilation zu fördern16,17. PII bildet außerdem einen Komplex mit der Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP)-Untereinheit der Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase, die den ersten Schritt der Fettsäurebiosynthese katalysiert), um die ACCase-Aktivität zu hemmen18,27. Darüber hinaus kann PII an der negativen Regulierung der N-Aufnahme beteiligt sein und eine übermäßige Nitritaufnahme in Landpflanzen verhindern28,29. Um den Einfluss der Abwesenheit von PII bei Asteraceae zu bewerten, haben wir transgene Salatpflanzen erzeugt, die ein exogenes PII-Gen aus Karotte (Da. carota), Tomate (Solanum lycopersicum) bzw. Arabidopsis (A. thaliana) exprimieren. Die PIIs aus Karotte/Tomate stellen die kanonischen PIIs mit pflanzenspezifischen Glutaminbindungsstellen dar, die bei Arabidopsis teilweise gelöscht wurden (Supplementary Note 20 und Supplementary Abb. 49). In Übereinstimmung mit früheren Berichten30 war AtPII in AtPII-exprimierenden transgenen Salaten im Chloroplasten lokalisiert (Abb. 3e und ergänzende Abb. 50 und 51). Die In-vivo-Tests (Bimolecular Fluoreszenz Complementation-BiFC) und In-vitro-Tests (Pull-down) unterstützen nachdrücklich die Wechselwirkungen zwischen AtPII, DcPII, SlPII und NAGK in Salat (Abb. 3e, f, ergänzende Abb. 52 und ergänzende Anmerkung 20). ). Der Nitrat-N-Gehalt und die ACCase-Aktivität waren in den transgenen Pflanzen signifikant niedriger (Ergänzende Abbildung 52 und Ergänzende Anmerkung 20). Im Vergleich zu Wildtyp-Salat war der Gesamtgehalt an freien Aminosäuren, insbesondere Glutaminsäure, Glutamin und Arginin, in den DcPII- und SIPII-exprimierenden transgenen Pflanzen signifikant erhöht, während er in AtPII-exprimierenden Linien verringert war (Ergänzende Abb. 52 und). Ergänzende Anmerkung 20). Obwohl die spezifischen Gründe untersucht werden sollten, besteht der starke Verdacht, dass Unterschiede in den Glutaminbindungsstellen von PII-Proteinen einen Einfluss haben (Ergänzende Anmerkung 21). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass exogenes PII das ursprüngliche NC-Gleichgewicht im Salat stören könnte.

Das nahezu universelle Vorkommen von PII in fast allen Lebensbereichen deutet darauf hin, dass sein Fehlen in den Asteraceae zu einer umfassenden Neuprogrammierung des NC-Gleichgewichtssystems führen sollte. Daher untersuchten wir die verschiedenen Genome auf das Vorhandensein von Genen, die an der N-Absorption und dem N-Metabolismus beteiligt sind. Asteraceae hatten im Vergleich zu den anderen Arten, einschließlich Sc, deutlich mehr Mitglieder der Genfamilien Nitrattransporter 2 (NRT2) und NRT3, die Zweikomponententransporter kodieren, die an der Nitratassimilation mit hoher Affinität beteiligt sind31. Taccada (P < 0,01; Abb. 4a, f). Diese Beobachtung stand im Einklang mit der raschen Ausdehnung der N-Reservoir-Orthologen im Kronenknoten von Asteraceae (Ergänzende Abbildung 37 und Ergänzende Anmerkung 22).

a, f Anzahl der Gene für die Familien Nitrattransporter 2 (NRT2) und NRT3 in Asteraceae und anderen Landpflanzenarten. **P < 0,01 und ***P < 0,001, bestimmt durch zweiseitigen Student-t-Test. Die Anzahl (n) der Datenpunkte für jede Gruppe wird unten angezeigt. Die Daten werden als Mittelwerte +/−SD dargestellt. b, g Ka/Ks-Wert orthologer Genpaare (Sc. taccada versus La. sativa) und paraloger Genpaare (La. sativa versus La. sativa) der Mitglieder der Klade I NRT2 (d) und der Klade III NRT3 (i). c, h Mikrosyntenie-Visualisierung von NRT2- (d) und NRT3-Syntelogs der Klasse III (i) im Sc. Taccada- und La. sativa-Genomen. Orthologe NRT2- und NRT3-Paare werden durch grüne Linien hervorgehoben. d, i Vereinfachter phylogenetischer Baum von NRT2 (d) und NRT3 (i) in Asteraceae-Arten und anderen Arten. Die Gene der Asteraceae-Arten sind dunkelrot markiert, während Kladen anderer Arten kollabiert sind. e, j NRT2 (e) und NRT3 (j) Expression in verschiedenen Geweben von vier repräsentativen Asteraceae-Arten. Die FPKM-Werte von Genen in verschiedenen Geweben werden zeilenweise skaliert, um das Gewebe mit der höchsten Expression hervorzuheben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Kolinearitätsanalyse zwischen Salat und Sc. Taccada ergab, dass die Erweiterung der NRT2- und NRT3-Familien durch das WGT-Ereignis initiiert wurde und hauptsächlich durch Tandem-Duplikationen erfolgte (Abb. 4c, h). Die NRT2 von Asteraceae gruppieren sich hauptsächlich in den Klassen I und II eines rekonstruierten phylogenetischen Baums (Abb. 4d und ergänzende Abb. 53) mit bevorzugter Expression in der Wurzel (Abb. 4e und ergänzende Abb. 54). Diese Gene gruppierten sich zusammen mit wichtigen Mitgliedern hochaffiner Nitrattransporter in Arabidopsis, einschließlich Genen, die hauptsächlich in Wurzeln funktionieren, wie NRT2.1 (At1g08090), NRT2.2 (At1g08100) und NRT2.6 (At3g45060) (ergänzende Abb. 53 und Ergänzende Anmerkung 22)31. In ähnlicher Weise gruppierten sich NRT3-Mitglieder in Asteraceae hauptsächlich in zwei Kladen (II und III; Abb. 4i) und wurden bevorzugt in der Wurzel exprimiert (Abb. 4j und ergänzende Abb. 55 und 56). Der Ka / Ks-Wert orthologer Genpaare und paraloger Genpaare der NRT2- und NRT3-Mitglieder der Klade I und der Klade III zeigte an, dass alle duplizierten Gene während der Evolution einer reinigenden Selektion unterzogen wurden (Abb. 4b, g und Ergänzende Anmerkung 22). Diese Beobachtungen zeigen eine Ausweitung der hochaffinen Nitrattransporter in Asteraceae über WGT und anschließende Tandem-Duplikationen.

Ein weiterer starker genomischer Fußabdruck des PII-Verlusts bestand darin, dass die mit dem Fettsäurestoffwechsel in Asteraceae verbundenen Gene an TRRs angereichert waren, sich schnell ausgeweitet hatten und zahlreiche InterPro-Einträge aufwiesen (Supplementary Data 1–5, Supplementary Abb. 17b und 57–59 und Supplementary). Anmerkung 23). Dementsprechend analysierten wir die Schlüsselgene der Fettsäurebiosynthese, also ADSs, FADs und 3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Synthasen (KASs). Alle drei Familien waren bei Asteraceae im Vergleich zu den anderen Arten signifikant erweitert (P <0, 01; Abb. 5a und ergänzende Abb. 60–63). Zum Beispiel der Sc. Das Taccada-Genom enthielt nur drei FAD-Gene, während das Genom der Asteraceae-Arten mindestens 14 FADs enthielt (Abb. 5b und Ergänzende Anmerkung 23). Wir haben die Mechanismen erforscht, die die Ausbreitung dieser Genfamilien steuern. Ähnlich wie bei den NRT-Familien erfolgte die Erweiterung der ADS-, FAD- und KAS-Familien zunächst über das WGT-Ereignis und anschließend durch Tandemduplikationen (Abb. 5c, Ergänzende Anmerkung 23 und ergänzende Abbildungen 60–65).

eine Reihe von Genen für ADSs, FADs und KASs in den sieben Asteraceae-Arten und 22 anderen Landpflanzen. ****P < 0,0001, bestimmt durch zweiseitigen Student-t-Test. Die Anzahl (n) der Datenpunkte für jede Gruppe wurde unterhalb der x-Achsen angezeigt. Die Daten werden als Mittelwerte +/−SD dargestellt. b Vereinfachte phylogenetische Bäume von ADSs, FADs und KASs in den sieben Asteraceae-Arten, Sc. Taccada und 21 repräsentative Landpflanzen. Die Gene der Asteraceae-Arten und Sc. Taccada sind wie angegeben mit verschiedenen Farben und Sternen markiert, und Kladen anderer Arten sind kollabiert. c Mikrosyntenie-Visualisierung typischer ADSs-, FADs- und KASs-Genexpansionsmuster in den repräsentativen Asteraceae-Arten und Sc. Taccada. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Genomsequenzierung und -vergleich enthüllten ein einzigartiges Szenario in der Evolution der Korbblütler. Vor der Spaltung zwischen Asteraceae und Goodeniaceae wurde der PII-Locus durch eine große chromosomale Inversion in die Nähe des Telomers gebracht, von dem wir annehmen, dass es anschließend aufgrund einer Mikroinversion verloren ging (Abb. 3). Im Vergleich zu anderen höheren Pflanzen und Goodeniaceae-Arten entwickelten die Asteraceae eine schrittweise Verbesserung des NC-Gleichgewichtssystems, zunächst durch die WGT, die etwa 78–82 MYA auftrat (Abb. 2a), und anschließend durch Tandem-Duplikationen. Im Asteraceae-System erhöhte die Erweiterung der hochaffinen Nitrattransportergene möglicherweise deren Fähigkeit, N aufzunehmen (Abb. 6 und Ergänzende Anmerkung 22), insbesondere in N-armen Umgebungen (Abb. 4). Darüber hinaus würde die Aufhebung der PII-Hemmung die ACCase-Aktivität erhöhen (Abb. 3) und mehr Substrate für die Fettsäurebiosynthese bereitstellen (Abb. 6b und Ergänzende Anmerkung 23), was durch die Erweiterung der Fettsäurebiosynthesegene FADs, KASs, erfüllt würde. und ADSs (Abb. 5). Daher schlagen wir vor, dass die Asteraceae nach dem Verlust von PII ein einzigartiges NC-Gleichgewichtssystem entwickelt haben, was zu einer erhöhten N-Aufnahmekapazität und Fettsäurebiosynthese führte (Abb. 6), was ihre hohe Artenvielfalt erklären könnte hervorragende Anpassungsfähigkeit.

ein kanonisches NC-Gleichgewichtssystem für Arten, die PII enthalten. Die Struktur von trimerem PII wurde von der Proteindatenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/2O67) heruntergeladen. b Das abgeleitete NC-Gleichgewichtssystem bei Asteraceae ohne PII. Die verstärkte Aufnahme von N sowie die Assimilationsprozesse von N und C sind in fetter roter Schrift dargestellt. Die Regulationsprozesse wurden durch Linien angedeutet, während die gestrichelten den biologischen Prozess darstellten, der nicht direkt bestätigt, sondern höchst spekulativ ist.

Auf Genomduplikationen basierende genomische Neuheiten tragen zur Artbildung und adaptiven Strahlung bei und ermöglichen es Organismen folglich wahrscheinlich, neue ökologische Möglichkeiten zu nutzen oder neue Umweltherausforderungen zu bewältigen13,15,32. In Übereinstimmung mit früheren Berichten2,9,12 schätzten wir, dass die frühe Paläopolyploidisierung bei Asteraceae in der Nähe der Artbildung von Asteraceae und Goodeniaceae stattfand und bis in die späte Kreidezeit (~80 MYA) zurückreicht, die möglicherweise genetisches Material für die Verwaltung einer Reihe von Sprengstoffen lieferte Strahlungen im Eozän. Begrenzte empirische Belege deuten darauf hin, dass die häufig erhaltenen doppelten Gene nach der Paläopolyploidisierung in den kritischen stressbedingten Signalwegen die Schlüsselfaktoren sein könnten, die die Anpassungsfähigkeit teilweise verbessern. Beispielsweise blieben Gene, die die Zellwand als Reaktion auf niedrige Temperaturen und Dunkelheit verändern, häufig nach WGDs erhalten, als globale Abkühlung und Dunkelheit die beiden Hauptstressfaktoren waren33. Die Untersuchung der Duplikate der MADS-Box-Genfamilie in den Kern-Eudikotyledonen deutete darauf hin, dass das WGT-γ-Ereignis wahrscheinlich die funktionelle Diversifizierung der Entwicklungsregulatoren der Blütenorgane initiierte, die morphologische Innovation von Blüten begünstigte und möglicherweise die adaptive Strahlung der Kern-Eudikotyledonen förderte32. Insbesondere mit Sc. Taccada als Referenz ermöglichte es uns, unabhängig voneinander erhaltene Gene nach der Paläopolyploidisierung in den Asteraceae-Arten zu erhalten. Interessanterweise beobachteten wir, dass die mit Zellwandbiosynthese, Proteinphosphatase, Blüte und Fettsäurebiosynthese verbundenen Gene gleichzeitig in den TRRs der untersuchten Asteraceae-Genome angereichert waren (P < 0,05) und mehrere lebenswichtige Familien mit der Anpassungsfähigkeit in Zusammenhang stehen, wie z. B. MADS -Box, PMEs und ADSs (Ergänzende Abbildung 17b). Daher hängt diese voreingenommene Genretention nach WGDs möglicherweise mit der Anpassungsfähigkeit und Artbildung von Asteraceae zusammen.

Darüber hinaus erhöht die Sub-/Neofunktionalisierung lebenswichtiger doppelter Gene die genetische Vielfalt und erleichtert möglicherweise die adaptive Evolution bei Asteraceae. Zu diesen Genen gehören essentielle Regulatoren und verteidigungsbezogene funktionelle Gene (Ergänzende Anmerkung 17). Beeindruckenderweise führten die Anzeichen einer dramatischen Verstärkung und Differenzierung der FERONA-Genfamilie zu einer Vielzahl linienspezifischer Gene, begleitet von der Entstehung Asteraceae-spezifischer miRNAs (Ergänzende Anmerkung 17). Darüber hinaus bestimmte die Gendivergenz der Biosynthesewege für Alkaloide und Inulin möglicherweise die genetische Grundlage für diese Merkmale bei Asteraceae (Ergänzende Anmerkung 17). Als am häufigsten vorkommender Bestandteil des Genoms wirken (Retro-)Transposons durch ihre Insertion in Gene oder Promotorregionen und sind weitere wichtige Treiber, die die Divergenz von Genen und Genomen in Pflanzen bewirken. Beispielsweise regulieren die von der Transposase abgeleiteten Proteine ​​FHY3/FAR1 die Chlorophyll-Biosynthese in A. thaliana34. Hier beobachteten wir, dass (Retro-)Transposon-assoziierte Gene bei den Asteraceae signifikant höher waren, darunter mehrere Schlüsselgene wie RVT-Znf und RT_RNaseH_2. BDR4 (Ergänzende Abb. 22f). Darüber hinaus waren die Gene mit potenziell regulatorischen DNA-Elementen, die von (retro)transponierbaren Elementen abgeleitet waren, an einer Vielzahl biologischer Funktionen beteiligt, wie z. B. BDR4 (Supplementary Note 14 und Supplementary Abb. 22f). Unsere Beobachtungen stimmten mit anderen früheren Studien überein, die die wichtige Rolle repetitiver Sequenzen bei der Diversifizierung der Asteraceae-Genome widerspiegelten 35, 36. Alle oben diskutierten Daten liefern Belege für die Treiber und Auswirkungen der Genom- und Gendynamik auf die Artenstrahlung und die konservativen/innovativen Merkmale der Familie der Korbblütler.

Leistungsstarke Stickstoffaufnahme- und -absorptionssysteme sind für das Überleben von Pflanzen in nährstoffarmen Umgebungen unerlässlich und kommen insbesondere bei Korbblütlern vor. Als Vertreter der schnell wachsenden Asteraceae-Pflanze M. micrantha können ihre Metaboliten die Verfügbarkeit von Stickstoff erhöhen, indem sie die Mikroben anreichern, die an den Stickstoffkreislaufwegen beteiligt sind37. Hier haben wir festgestellt, dass PII, das eine Schlüsselrolle bei der Erkennung von Stickstoff- und Kohlenstoffsignalen in allen Lebensbereichen spielt, in den Asteraceae-Pflanzen verloren gegangen ist. Bei der Expression von exogenem PII in Salat können PII-Proteine ​​immer noch mit NAGK interagieren und die ACCase-Aktivität hemmen, was wiederum viele physiologische und metabolische Wege beeinflusst, wie z. B. die Störung der Aminosäuresynthese und der N-Aufnahme (Nitrat). Diese Veränderungen weisen darauf hin, dass Asteraceae, repräsentiert durch Salat, ein einzigartiges NC-Gleichgewichtssystem entwickelt hat. Angesichts der Tatsache, dass das PII-Sensorsystem für die Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase bei schwankender Stickstoffversorgung von Vorteil ist, ist es möglich, dass der Verlust von PII bei den Asteraceae-Vorfahren nicht nachteilig war. Aufgrund der Zunahme der NRT2/3-Gene über WGT und Tandem-Duplikation könnten die NRT2/3-Gene (als binäre), sogenannte hochaffine Nitrattransporter, Nitrat aus einer Umgebung mit niedriger Nitratkonzentration absorbieren und eine relativ reichliche Stickstoffversorgung bereitstellen. Dies führt dazu, dass die Nachteile des PII-Verlusts bei Asteraceae ausgeglichen werden. In dieser Situation entwickelten Asteraceae-Arten Kompensationssysteme weiter, um den PII-Verlust auszugleichen, was zu ihrer überlegenen Fitness und sukzessiven Strahlung führte.

Die veränderten genetischen Grundlagen des NC-Gleichgewichtssystems haben zweifellos vielfältigen Einfluss auf die Pflanzenphysiologie der Korbblütler und wirken sich letztlich auf die Anpassungsfähigkeit an die Umwelt aus. Die Genexpansion hochaffiner Nitrattransporter erhöhte objektiv die Fähigkeit von Pflanzen, Stickstoff aufzunehmen und damit ihre Anpassungsfähigkeit. Beispielsweise aktiviert die Glutamatsignalisierung Pflanzenreaktionen und Anpassung an Umweltstress38, zusätzlich zur Samenkeimung39, der Wurzelarchitektur40, der Pollenkeimung und dem Wachstum der Pollenschläuche41,42. Die Verwendung von Glutamat als Signalmolekül ist auch an der Reaktion und Anpassung an Salz, Kälte, Hitze, Trockenheit, Krankheitserreger und Wundstress beteiligt38,43,44. PII reguliert die Fettsäuresynthese in Chloroplasten durch Wechselwirkung mit dem ACCase-Komplex und hemmt dessen Aktivität. Bei Asteraceae bietet die Aufhebung der ACCase-Hemmung mehr mögliche Substrate für die Biosynthese von Fettsäuren (FA) und UFA (Abb. 6). Pflanzen haben ausgefeilte Strategien mit UFAs entwickelt, die sich als allgemeiner Verteidiger zur Vermeidung schädlicher Auswirkungen herausgestellt haben45,46.

Da der Verlust von PII bei Asteraceae möglicherweise beim Vorfahren von Goodeniaceae und Asteraceae (~80 MYA) aufgetreten ist, hat sich das einzigartige NC-Gleichgewichtssystem bei Asteraceae über einen langen Zeitraum hinweg entwickelt, was möglicherweise zu komplizierten Veränderungen im Vergleich zu anderen Pflanzen mit PII führte. Weitere Studien zur vollständigen Untersuchung der physiologischen und metabolischen Anpassungsmechanismen, die auf dem einzigartigen NC-Gleichgewichtssystem in Asteraceae basieren, sind weiterhin erforderlich. Aufgrund der geografischen Verteilung und der Verfügbarkeit genomischer Informationen konnten wir die Calyceraceae, die andere Schwesterlinie der Asteraceae und die gemeinsame WGT-125, nicht einbeziehen. Die angemessene Probenahme der Genome von Calyceraceae und basalen Unterfamilien von Asteraceae (z. B. Barnadesioideae, Famatnanthoideae und Stifftioideae) wird uns in Zukunft dabei helfen, das einzigartige NC-Gleichgewichtssystem in Asteraceae und seine Evolutionsgeschichte vollständig aufzudecken. Basierend auf dem detaillierten Verständnis dieses einzigartigen NC-Gleichgewichtssystems könnten durch die Rekonstruktion des NC-Systems Strategien zur Verbesserung der Ernte, insbesondere zur Bewältigung der globalen Klimaherausforderungen, entwickelt werden.

Stängelsalat (Lactuca sativa var. angustana) wurde im Frühjahr 2018 im Gewächshaus der Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (BAAFS), Peking (39°94´N und 116°28´E) und Scaevola taccada gepflanzt Setzlinge wurden in Haikou, Provinz Hainan (20°03´N und 110°12´E) gesammelt und im Sommer 2019 in einer künstlichen Klimakammer bei BAAFS gepflanzt.

Proben für die De-novo-Zusammensetzung wurden von einer einzelnen Salatpflanze und einem einzelnen Sc gesammelt. Taccada-Pflanze. Für die Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung (SMRT) wurde genomische DNA mit einem Blood & Cell Culture DNA Midi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) isoliert. Die 20-kb-Bibliotheken wurden mit SMRTbell Template Prep Kits (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA) erstellt und auf einem PacBio RS II-Gerät (Pacific Biosciences) unter Verwendung des P6-C4-Sequenzierungsreagenzes sequenziert. Für HiSeq-Analysen wurde DNA mithilfe von Plant Genomic DNA-Kits (Tiangen, Peking, China) isoliert. Bibliotheken mit 450-bp-Inserts wurden auf einer Illumina HiSeq X-Plattform (San Diego, CA, USA) für 150-bp-Paired-End-Reads vorbereitet und sequenziert. Junge Blätter wurden für die optische Kartierung verwendet, indem hochmolekulare DNA isoliert wurde, die dann nach der Isolierung mit dem Direktmarkierungsenzym DLE-1 markiert wurde. Die markierten DNA-Proben wurden mit einem BioNano Irys-System (Bionano Genomics, San Diego, CA, USA) abgebildet und für die weitere Analyse wurden nur Moleküle >150 kb verwendet. Für die Hi-C-Bibliothek wurden Blätter in 1 % (v/v) Formaldehyd fixiert und die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von Glycin beendet. Anschließend wurden die Blattabschnitte aus der Mischung entnommen, mit ddH2O gespült und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemahlen, um vernetzte DNA zu isolieren. Die isolierte vernetzte DNA wurde gereinigt, mit MobI-Enzymen verdaut und mit Biotin markiert. Die mit Biotin markierten DNA-Fragmente wurden eingefangen und PCR-angereichert, um die Hi-C-Bibliothek47 aufzubauen. Die Hi-C-Bibliothek wurde auf einer Illumina HiSeq X-Plattform als 150-bp-Paired-End-Reads sequenziert. Blatt-, Blüten-, Wurzel- und Stängelproben wurden separat für die Transkriptom-Tiefensequenzierung (RNA-Seq) gesammelt. Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen) isoliert. Der Aufbau der RNA-seq-Bibliothek wurde gemäß dem Standardprotokoll des Herstellers (Illumina) durchgeführt und auf einer Illumina HiSeq X-Plattform sequenziert.

Die Jellyfish-Software (v2.0)48 wurde zur Berechnung der k-mer-Häufigkeit (k-mer-Länge 21) verwendet. Anschließend wurde Genomescope (v1.0.0)49 verwendet, um die Heterozygotie des Genoms, den Wiederholungsgehalt und die Genomgröße aus den Sequenzablesungen abzuschätzen .

Zarte Blätter wurden vom sequenzierten Sc gesammelt. Taccada-Pflanze entnommen und mit einem Durchflusszytometer analysiert. Proben von Schwarzpappel (Populus trichocarpa) (2n = 2x = 38) und Tomaten (Solanum lycopersicum) (2n = 2x = 24) wurden als Genomgrößenreferenzen analysiert. Über 5000 Kerne pro Probe wurden gesammelt und mit einem CyFlow Space-Durchflusszytometer (Partec, Deutschland) nachgewiesen, das mit einer UV-LED-Quelle (Emission bei 365 nm) und einem blauen Festkörperlaser (455 nm) ausgestattet war. Die Daten wurden mit Flomax2.8 (Sysmex Partec, Frankreich) mit einem Variationskoeffizienten <5 % analysiert.

Der Aufbau des Stammsalatgenoms erfolgte schrittweise. Zunächst wurde Falcon (v0.4)50 verwendet, um die ersten Contigs zu erhalten. Dann wurde ein erster Polierschritt mit Arrow (v2.2.3) unter Verwendung von reinen PacBio-Long-Reads durchgeführt, und dann wurde Pilon (v1.20)51 verwendet, um die Sequenzierungsfehler in den Contigs mit genauen Illumina-Short-Reads zu korrigieren. Optische Bionano-Karten wurden mit BioNano Solve v3.0.1 (https://bionanogenomics.com/) zu physikalischen Konsenskarten zusammengesetzt. Um die Hybridgerüste in den Chromosomen zu verankern, wurden die Hi-C-Sequenzierungsdaten von Juicer (v1.5)52 und 3D-DNA (v201008)53 in Gerüsten ausgerichtet.

Der PacBio liest vom Sc. Das Taccada-Genom wurde mit dem Lesekorrekturmodul der CANU-Pipeline (v1.7.1)54 korrigiert. Die De-novo-Montage wurde mit der WTDBG2-Software (v2.5)55 im CCS-Modus durchgeführt. Um die Hybridgerüste in den Chromosomen zu verankern, wurden die Hi-C-Sequenzierungsdaten wie für Stammsalat beschrieben in Gerüsten ausgerichtet.

Die Qualität der Genomassemblierung wurde auf verschiedenen Ebenen bewertet. Illumina-Messwerte mit hoher Einzelbasisgenauigkeit wurden mit BWA (0.7.12-r1039)56 abgeglichen. Korrekt zugeordnete Lesevorgänge wurden berechnet, um den korrekten Montagegrad widerzuspiegeln. Die Grundgenauigkeit der Sequenzierung wurde durch Berechnung des Qualitätswerts (QV) der Baugruppe21,22 bestimmt. Kurz gesagt wurde der Aufruf von Single Nucleotide Polymorphism (SNP) basierend auf den ausgerichteten Lesevorgängen mit SAMtools (v1.4)57 durchgeführt und die Anzahl der SNPs wurde mit einer Phred-Skalierung von >30 und einer Abdeckung von >3 (n) gezählt. Gleichzeitig wurde auch die Anzahl der Genompositionen mit Leseabdeckung >3 berechnet (N). Schließlich wurde der QV der Baugruppe wie folgt berechnet:

Die Vollständigkeit der Genlandschaft wurde anhand von Expressionsdaten geschätzt, einschließlich RNA-seq- und EST-Daten (Expressed Sequence Tag). Salat-ESTs von GenBank wurden mit dem BLAST-ähnlichen Alignment-Tool (v0.36) mit Standardparametern an den zusammengesetzten Genomen ausgerichtet58. Die in dieser Studie generierten Lesevorgänge aus verschiedenen Salat- und Sc. Taccada-Gewebe (Wurzeln, Blätter, Blüten und Stängel) wurden mit Hisat2 (v2.1.2)59 auf die beiden Genome ausgerichtet. BUSCO wurde berechnet, um die Genomassemblierung und Annotationsvollständigkeit mit Einzelkopie-Orthologen zu bewerten60.

Die paarweise Ausrichtung zwischen unserem Salat-SL1.0-Genom und dem zuvor veröffentlichten Blattsalat-Genom (dem Lsa_v1-Genom)14 wurde von Minimap2 (v2.18)61 durchgeführt und über Minidot (https://github.com/thackl/minidot) visualisiert. Die Zusammenstellung von Wiederholungssequenzen wurde mit dem LAI-Programm (Long Terminal Repeat Assembly Index)23 bewertet, das die Kontiguität einer Zusammenstellung mithilfe von Retrotransposons mit langen terminalen Wiederholungen (LTR-RTs) bewertet. Die LTR_retriever-Pipeline (v2.9.0)62 wurde verwendet, um die von LTR_FINDER (v1.0.7)63 und LTRharvest (v1.5.9)64 identifizierten Kandidaten-LTR-RTs zu integrieren. Der Gesamtgenom-LAI wurde dann basierend auf der von LTR_retriever generierten LTR-RT-Bibliothek berechnet.

Die beiden Genome wurden mit derselben Pipeline annotiert. Für Wiederholungssequenzen wurde eine maßgeschneiderte Wiederholungsbibliothek erstellt, die bekannte und neue Wiederholungsfamilien umfasst. Miniatur-invertierte transponierbare Elemente (MITEs) der beiden Baugruppen wurden mit MITE-Hunter (v1.0)65 mit Standardparametern durchsucht. Anschließend wurde die LTR_retriever-Pipeline verwendet, um die von LTR_FINDER und LTRharvest identifizierten Kandidaten-LTR-RTs zu integrieren. Eine anfängliche Wiederholungsmaskierung der Genome wurde mit der Wiederholungsbibliothek durchgeführt, die durch Kombination der identifizierten MITEs und LTR-RTs abgeleitet wurde. Das wiederholt maskierte Genom wurde in RepeatModeler (v1.0.11)66 hochgeladen, um Wiederholungsfamilien zu identifizieren. Schließlich wurden alle identifizierten Wiederholungssequenzen kombiniert und mit einer Pflanzenproteindatenbank (Swiss-Prot, https://www.uniprot.org/) abgeglichen, die von Transposons kodierte Proteine ​​ausschloss. Elemente mit signifikanter Ähnlichkeit zu Pflanzengenen wurden entfernt. RepeatMasker (v4.0.6)66 wurde verwendet, um nach ähnlichen transponierbaren Elementen (TEs) in der Repbase TE-Bibliothek und der benutzerdefinierten Wiederholungsbibliothek zu suchen.

Die proteinkodierenden Gene wurden aus dem wiederholungsmaskierten Genom mit MAKER-P (v2.31.10)67 vorhergesagt, das Beweise aus Proteinhomologie, Transkripten und Ab-initio-Vorhersagen integriert. Der auf Homologie basierende Beweis wurde durch Abgleichen von Proteinsequenzen aus sieben Pflanzenarten (Arabidopsis thaliana, Salat, Sonnenblume [Helianthus annuus], Artischocke [Cynara cardunculus var. scolymus], Chrysanthemum nankingense, Artemisia annua und Reis [Oryza sativa]) abgeleitet jede Genomanordnung.

Die aus vier verschiedenen Bibliotheken stammenden RNA-seq-Daten wurden de novo mit Trinity (v2.8.2)68 zusammengestellt. ESTs, die aus den NCBI-Nukleotid- und EST-Datenbanken (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotid/) extrahiert wurden, wurden auch zur Vorhersage von Genen verwendet. Zunächst wurden alle Transkriptsequenzen in die PASA-Pipeline (v2.4.1)68 hochgeladen, um die Alignment-Assemblierung durchzuführen. Fünftausend vollständige Genmodelle und Sequenzen wurden extrahiert, um die Parameter für SNAP (v1.0) und Augustus-Software (v3.0.3) zu trainieren69,70. Alle Daten und Vorhersagen wurden dann verwendet, um einen Konsens-Gensatz zu erstellen. Abschließend wurde die PASA-Pipeline erneut verwendet, um das erhaltene Genmodell zu verfeinern.

Um die Identifizierung von microRNA (miRNA) zu verfeinern, wurden die Lesevorgänge mithilfe von BWA56 auf das wiederholt maskierte Genom ausgerichtet und miRNAs wurden mithilfe von miRDeep2 (v0.1.3)71 identifiziert. Die Transfer-RNA- und ribosomalen RNA-Gene wurden mithilfe der Algorithmen tRNAscan-SE-Paket (v2.0.0)72 und RNAmmer (v1.2) mit Standardparametern73 vorhergesagt. Andere nichtkodierende RNAs wurden mit Infernal cmscan (v1.1.4)74 durch Suche in der Rfam-Datenbank (https://rfam.xfam.org/, Version 13.0) identifiziert.

OrthoFinder (v2.4.0)75 wurde zur Schlussfolgerung orthologer Gruppen in den 29 ausgewählten Arten verwendet. Die 29 Genome bestanden aus 7 Arten von Asteraceae, 8 aus der Ordnung der Asteriden, 6 aus den Gruppen der Rosiden, 3 aus einkeimblättrigen Gruppen und 5 alten Arten (Ginkgo biloba, Gemeine Fichte [Picea abies], Selaginella moellendorffii, Amborella trichopoda und Chinesisch). Tulpenbaum [Liriodendron chinense]). Gene mit niedriger Kopienzahl (LCN) wurden basierend auf den OrthoFinder-Ergebnissen mit den folgenden Anforderungen identifiziert: ausschließlich Einzelkopie in La. sativa, Sc. taccada, Se. moellendorffii, G. biloba und Weinrebe (Vitis vinifera) und Einzelexemplar bei mindestens 5 der 24 ausgewählten Arten76.

Zur Rekonstruktion des Artenbaums der 29 ausgewählten Arten wurden zwei unabhängige Methoden verwendet. Mehrere Alignments wurden mit MUSCLE (v3.8.31)77 durchgeführt. Als nächstes wurde trimAL (v1.2)78 verwendet, um ausgerichtete Regionen mit geringer Qualität mit der Option „-automated1“ zu trimmen. LCN-Genbäume wurden aus den verbleibenden Standorten mithilfe von RAxML (v.7.7.8)79 mit dem JTT + G + I-Modell für Aminosäuresequenzen geschätzt. Das am besten geeignete Modell wurde mit ModelFinder nach dem Bayes'schen Informationskriterium80 ausgewählt. Die phylogenetische Rekonstruktion wurde schrittweise mit einem sorgfältig ausgewählten Satz von 9784 Genen unter Verwendung der in ASTRAL (v5.5.1)81 implementierten Koaleszenzmethode durchgeführt. Darüber hinaus wurden die multiplen Alignment-Sequenzen der Gene in den 389 LCN OrthoGroups (OGs) verkettet und der Artenbaum mithilfe von RAxML rekonstruiert.

Die 389 LCN-Gene (185.822 Standorte) in jeder Art wurden verkettet und die Baumtopologie, die aus unserer koaleszenzbasierten Analyse der 9784 Gene aus 29 Taxa abgeleitet wurde, wurde festgelegt. Anschließend wurden eine bayesianische phylogenomische Datierungsanalyse der ausgewählten Gene in MCMCtree, Teil des PAML-Pakets (v4.10.0)82, und eine Berechnung der ungefähren Wahrscheinlichkeit für die Zweiglängen durchgeführt. Die molekulare Datierung wurde unter Verwendung eines autokorrelierten Modells der Variation der Raten zwischen den Abstammungslinien, des JC69-Substitutionsmodells und eines einheitlichen Priors für die relativen Knotenzeiten durchgeführt. Posterior-Verteilungen des Knotenalters wurden mithilfe der Markov-Ketten-Monte-Carlo-Stichprobe geschätzt, wobei alle 200 Schritte über 10 Millionen Schritte nach einem Einbrennen von 200.000 Schritten Stichproben gezogen wurden. Die Penalized-Likelihood-Methode unter einer variablen Substitutionsrate unter Verwendung von r8s (v1.8.1) wurde ebenfalls implementiert. Drei Fossilkalibrierungen, die den Kronengruppen Angiospermen (~ 126 Millionen Jahre), Eudikotyledonen (~ 120 Millionen Jahre) und Monokotyledonen (~ 113 Millionen Jahre) entsprechen, wurden als Mindestaltersbeschränkungen in unserer Analyse der bestraften Wahrscheinlichkeitsdatierung implementiert83. Der beste Glättungsparameterwert der verketteten LCN-Gene wurde durch Kreuzvalidierung eines Bereichs von Glättungsparametern von 0,01 bis 10.000 ermittelt (Algorithmus = TN; crossv = ja; cvstart = 0; cvinc = 0,5; cvnum = 15). Schließlich wurde eine entspannte molekulare Uhr über die paarweise Divergenzzeit auf der TIMETREE-Website (http://www.timetree.org/)84 kalibriert und die Artendivergenzzeit wurde mit r8s (v1.8.1)85 geschätzt. Die CAFÉ-Software (v4.2.1)86 wurde verwendet, um die Entwicklung der Genfamilie auf der Grundlage des Stammbaums und orthologer Gruppen zu berechnen.

Der Sc. Taccada, Salat, Sonnenblume, Artischocke, Ch. Nankingense- und Kaffeegenome (Coffea arabica) wurden verglichen. Synteny-Vergleiche wurden von MCscan (v1.3.6)87 mit Standardparametern zur Vorhersage von Paralogs und Orthologs identifiziert. Die Sequenzdivergenz von Paralogen (innerhalb jedes Genoms) und Orthologen (zwischen Sc. sericea und einem anderen Genom) wurde auf der Grundlage synonymer (Ks) Substitutionen unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode berechnet, die im Codeml des PAML-Pakets88 unter dem F3x4-Modell implementiert ist.

Die dreifach erhaltenen Regionen (TRRs) wurden über die Chromosomen-Genome der Asteraceae-Arten Salat, Artischocke, Sonnenblume und Mikania micrantha definiert. Nach dem WGT-1-Ereignis traten keine weiteren WGD-Ereignisse im Salat- und Artischockengenom auf. Bei Sunflower und M. micrantha kam es jedoch nach WGT-1 zu einem weiteren WGD-Ereignis. Zuerst der Sc. Das Taccada-Genom wurde von MCscan87 als gemeinsame Referenz zur Generierung orthologer Regionen im Vergleich zu anderen ausgewählten Asteraceae-Genomen verwendet. Für Salat und Artischocke passen jeweils die drei besten Sc. Die Taccada-Region wurde extrahiert, um das Layout für die Äquivalente auf Genebene zu berechnen. Die Genomregionen, die aufeinanderfolgende dreifache homologe Gene enthielten, wurden als TRRs definiert. Für Sunflower und M. micrantha sind die sechs besten Übereinstimmungen mit jedem Sc. Die Taccada-Region wurde extrahiert und die genomischen Regionen, die vier, fünf und sechs aufeinanderfolgende Kopien homologer Gene enthielten, wurden als TRRs definiert.

Die genomische Zusammensetzung der TRRs in den Asteraceae-Arten wurde weiter untersucht. Die Wiederholungssequenzen wurden integriert und mit Extensive de novo TE Annotator (EDTA, v2.0.0)89 versehen. Zum Vergleich wurde die genomische Zusammensetzung (genische oder repetitive Sequenzen) innerhalb von 1-MB-Fenstern und 1-MB-Schritten über das Genom berechnet. Paarweise Datenarrays wurden einem zweiseitigen Student-t-Test unterzogen, um die Signifikanz der Differenz zu untersuchen. Jede repetitive Sequenzfamilie wurde einem hypergeometrischen Test unterzogen, um die Anreicherung oder Erschöpfung der TRRs im Vergleich zu ihrer genomweiten Verteilung vorherzusagen. Eine mehrfache Testkorrektur wurde mit der False-Discovery-Rate-Methode (FDR) durchgeführt und der angepasste Schwellenwert wurde auf P < 0,01 festgelegt.

Die Genontologie (GO) wurde in den TRRs mit Cytoscape (v3.8.2)90 durchgeführt. Deutlich angereicherte GO-Terme (P <0,01), die von den Genomen gemeinsam genutzt werden, wurden mithilfe des ggplot2-Pakets identifiziert und visualisiert. Die überrepräsentierten Genfamilien in den TRRs wurden mithilfe eines hypergeometrischen Tests untersucht.

Die Funktion der von allen vorhergesagten Genen kodierten Proteine ​​wurde mit InterProScan (v5.24)91 durch Durchsuchen einer öffentlich zugänglichen Datenbank annotiert. Die Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-IDs für jedes Gen wurden gemäß dem entsprechenden InterPro-Eintrag zugewiesen. Die Anreicherungsanalyse wurde basierend auf den funktionellen Domänen aller kodierten Proteine ​​der 29 Arten unter Verwendung des Fisher-Tests mit einer FDR-Korrektur durchgeführt.

Nach dem Abschneiden der Adaptersequenzen und dem Entfernen minderwertiger Lesevorgänge wurden die RNA-Seq-Daten jeder Probe mithilfe von Hisat 2 (v2.1.2)59 und StringTie (v1.3.4)92 mit Standardparametern auf die Referenzgenome abgebildet. Die Genexpressionsniveaus wurden als Fragmente pro Kilobase Exon pro Million kartierter Fragmente (FPKM) normalisiert.

Die für die PII-Funktionsstudie verwendeten Pflanzengewebe stammten von der Salatsorte „Grand Rapids“. Oberflächensterilisierte Samen wurden auf Agarplatten von Murashige und Skoog (MS) gekeimt, die 3 % (Gew./Vol.) Saccharose und 0,8 % (Gew./Vol.) Agar enthielten, wobei der pH-Wert mit KOH auf 5,8 eingestellt wurde. Die Pflanzen wurden in Wachstumskammern bei 25 °C und einer Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gezüchtet. Die PII-cDNA voller Länge aus Karotte (DcPII, DCAR_002917), Tomate (SIPII, Solyc06g009400.3.1) und Arabidopsis (AtPII, AT4G01900) wurde jeweils in einen Pflanzenexpressionsvektor (pYBA1132) kloniert und dann mit Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens, Stamm EHA105) unter Verwendung der Blattscheibentransformationsmethode93.

Die Gesamt-RNA wurde aus Salatsämlingen unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert und mit DNase I (TaKaRa, Dalian, China) behandelt, um eine Kontamination der genomischen DNA zu beseitigen. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) und Zufallsprimern (Promega, Madison, WI, USA) revers in cDNA transkribiert. Die relative PII-Expression wurde unter Verwendung des Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) auf einem ABI 7500 Thermocycler (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Primer wurden mit Primer Premier 5 (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/) entworfen (Supplementary Data 15). Für jede Probe wurden drei biologische Replikate durchgeführt. Salat-TUBULIN (TUB) wurde als interne Referenz zur Normalisierung der Daten verwendet. Die Primer waren TUB-F: 5'-TAGGCTGTGAGTGAGCAGT-3' und TUB-R: 5'-AACCCTCGTACTCTGCCTCTT-3'. Die fache Änderung der Genexpressionswerte wurde mit der 2–ΔΔCt-Methode (Zyklusschwelle) berechnet. Die relativen Genexpressionswerte wurden mit SigmaPlot Version 10.0 (SYSTAT Software, Inc., https://systatsoftware.com/) aufgezeichnet.

Die Blätter transgener Pflanzen, die das von pYBA1132 abgeleitete Konstrukt tragen, das die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimiert, wurden zur Fluoreszenzbeobachtung in kleine Quadrate geschnitten. Die Fluoreszenz von GFP oder Chloroplasten-Autofluoreszenz wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (ZEISS710; Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) beobachtet.

Die kodierenden Regionen von PIIs in drei Arten und LsNAGK wurden an den pMal-C5x- bzw. pGEX-4T-1-Vektor ligiert. Konstruierte Plasmide wurden in kompetente Escherichia coli BL21-Zellen (ZOMANBIO, Peking, China) transformiert. Zur Negativkontrolle wurden auch leere Vektoren in die kompetenten Zellen transformiert. Die Zellen wurden in Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600 0,5 erreichte, und dann auf 16 °C abgekühlt. Fügen Sie dem Medium IPTG bis zur Endkonzentration von 200 μM hinzu und kultivieren Sie es über Nacht in einem Inkubator bei 160 U/min und 16 °C. Das MBP- und MBP-fusionierte PIIs-Protein wurde mit Amylose Resin (NEB, MA, US) gereinigt. Das GST- und GST-fusionierte LsNAGK-Protein wurde mit GST MagBeads (Sangon Biotech, Shanghai, China) gereinigt.

Gereinigtes GST- und GST-fusioniertes LsNAGK-Protein (10 nmol) wurden auf den GST-Magnetkügelchen adsorbiert. MBP und MBP-fusionierte PIIs-Proteine ​​wurden in das System gegeben und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Magnetkügelchen zweimal gewaschen und 15 Minuten lang in 1 × SDS-Ladepuffer gekocht und mittels Western Blot unter Verwendung von Anti-GST- und Anti-MBP-Antikörpern (Yeasen, Shanghai, China) analysiert.

Für das Experiment zur bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) wurden die konstruierten Plasmide und leeren Vektoren in die kompetenten Agrobacterium EHA105-Zellen (Coolaber, Peking, China) transformiert. Gleichzeitig wurde Agrobacterium GV3101, das das P19-Expressionsprotein trägt, kultiviert. Verschiedene Kombinationen von cYFP-, nYFP- und P19-Agrobakteriumlösungen wurden gemeinsam in die Blätter von Nicotiana benthamiana infiltriert. Die Fluoreszenzsignale wurden mit dem konfokalen Nikon A1-Mikroskop erfasst. Das YFP-Signal wird mit einem Laser bei 488 nm angeregt. Wir haben auch die Autofluoreszenz von Chloroplasten bei 665 nm nachgewiesen, um die Position von LsNAGK und PIIs zu bestimmen.

Frische Pflanzen wurden geerntet, sofort eingefroren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemahlen. Um den Gehalt an freien Aminosäuremonomeren zu bestimmen, wurden Proben mit 0,1 M Salzsäure extrahiert und mit Waters AccQ•Tag-Reagenz derivatisiert. Die Probenextrakte wurden mit einem UPLC-Orbitrap-MS-System analysiert (UPLC, Vanquish Ultra-High-Performance-Flüssigkeitschromatographiesystem; MS, Q Exactive Hybrid Q-Orbitrap-Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific, USA). Der Gesamtgehalt an freien Aminosäuren wurde als Summe der Gehalte von 25 freien Aminosäuremonomeren berechnet.

Die ACCase-Aktivität wurde mit der Molybdänblau-Methode (Boxbio, Peking, China) nachgewiesen. Kurz gesagt, ACC kann Acetyl-Coenzym A, NaHCO3 und ATP katalysieren, um Malonyl-CoA, ADP und anorganischen Phosphor zu erzeugen. Molybdänblau und Phosphat erzeugen eine Substanz mit einem charakteristischen Absorptionspeak bei 660 nm. Die ACC-Aktivität wird durch Messung des Anstiegs von anorganischem Phosphor mithilfe der Ammoniummolybdat-Phosphor-Bestimmungsmethode bestimmt. Wir haben die ACCase-Aktivität von Wildtyp- und überexprimierendem PIIs-Salat mit dem BioTek Synergy H1 Multimode Microplate Reader (Agilent, Santa Clara, CA, USA) für drei biologische Replikate und drei technische Replikate gemessen.

Der Nitratstickstoffgehalt wurde mit der Nitrosalicylsäure-Methode unter Verwendung des entsprechenden Testkits (Boxbio, Peking, China) gemessen. Kurz gesagt, NO3− kann mit Salicylsäure unter der Bedingung einer konzentrierten Säure unter Bildung von Nitrosalicylsäure reagieren, die bei einem pH-Wert>12 gelb erscheint. Innerhalb eines bestimmten Bereichs ist die Farbtiefe proportional zum Inhalt. Wir haben den Nitratstickstoffgehalt von Wildtyp- und überexprimierendem PIIs-Salat mit dem BioTek Synergy H1 Multimode Microplate Reader (Agilent, Santa Clara, CA, USA) für drei biologische Replikate und drei technische Replikate gemessen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie verwendeten Sequenzierungsdaten, zusammengesetzten Chromosomen, nicht platzierten Gerüste und Anmerkungen wurden im Genome Sequence Archive (GSA) und in der Genome Warehouse (GWH)-Datenbank im BIG Data Center unter dem Zugangscode PRJCA007442 hinterlegt. Kommentierte Informationen zu Stängelsalat im Detail finden Sie auch in LettuceGDB [https://lettucegdb.com/]94. Zusätzliche Dateien, einschließlich der angepassten Wiederholungsbibliothek, Genbäume und phylogenetischen Bäume, wurden auf Zenodo [https://zenodo.org/record/8058114]95 hochgeladen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Shen, F. et al. Vergleichende Genomik zeigt ein einzigartiges Stickstoff-Kohlenstoff-Gleichgewichtssystem bei Asteraceae, lettuce_data. zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.8058114 (2023).

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Wir danken Professor Hongzhi Kong und Professor Guangyuan Rao für die Diskussion und Kommentare. Die Finanzierung erfolgte durch die Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX201907-2, JKZX202201 und YXQN202203), das Beijing Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs (G20220628003-13) und die National Natural Science Foundation of China (31621001).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Fei Shen, Yajuan Qin, Rui Wang.

Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Institut für Biotechnologie, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, 100097, Peking, China

Fei Shen, Yajuan Qin, Xin Huang, Ying Wang, Jianhua Wei und Xiaozeng Yang

Pekinger Schlüssellabor für Entwicklung und Qualitätskontrolle von Zierpflanzen, Hochschule für Gartenbau, China Agricultural University, 100193, Peking, China

Rui Wang & Junna He

Staatliches Schlüssellabor für Protein- und Pflanzengenforschung, School of Advanced Agricultural Sciences, Universität Peking, 100871, Peking, China

Ying Wang, Yue Zhou & Lei Li

Staatliches Schlüssellabor für evolutionäre und systematische Botanik, Institut für Botanik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100093, Peking, China

Tiangang Gao und Yuannian Jiao

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XY, LL und JW haben diese Studie konzipiert. YW hat die Pflanzen angebaut und Proben gesammelt. FS führte die Genomassemblierung, Annotation und Datenanalysen durch. YQ, RW und XH generierten und analysierten die transgenen Salat-PII-Linien. YJ, YZ, JH und TG leisteten konzeptionelle Beratung. XY, FS und LL haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Jianhua Wei, Lei Li oder Xiaozeng Yang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Khaled Selim, Jisen Zhang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Shen, F., Qin, Y., Wang, R. et al. Vergleichende Genomik zeigt ein einzigartiges Stickstoff-Kohlenstoff-Gleichgewichtssystem bei Asteraceae. Nat Commun 14, 4334 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40002-9

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Eingegangen: 12. Oktober 2022

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 20. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40002-9

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